专利名称：一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于油菜育种技术领域。具体涉及一种控制甘蓝型油菜隐性核不育育性基因(BnMS3/ms3与&iRf/rf)区段分子标记，同时还涉及一种控制甘蓝型油菜隐性核不育性基因区段分子标记在选育油菜隐性核不育系与临保系中的用途。
背景技术：
杂种优势利用被认为是提高作物产量、改善品质的有效途径，而良好的授粉控制系统是杂种优势利用的关键所在。目前杂种优势利用途径主要有人工去雄、化学杀雄、自交不亲和、雄性不育等，其中雄性不育应用最为广泛。植物在有性繁殖的过程中不能产生正常花粉的遗传现象称为雄性不育，雄性不育可以分为细胞质雄性不育(CMQ和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中广泛的用于杂交种生产。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、 kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统，但是波里马不育系育性受温度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。 甘蓝型油菜细胞核雄性不育系由于育性表现稳定彻底，无胞质负效应，恢复源较为广泛，近年来倍受育种家关注。目前国内外利用的油菜核不育系主要有以下四种类型显性核不育、 两对隐性基因控制的核不育、互作型核不育和转基因核不育。中国四川省宜宾地区农科所 (1972)发现的宜3A是显性核不育系的典型代表，由于显性核不育恢复系较难选育，目前还没有选育出大面积推广的双低杂交组合。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1991) 是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂 6号” “蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等。该类系统主要缺陷是不育系中存在50%的可育株，在制种时需要在初花期人工拔除其中50%的可育株，不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。涂金星等O010)通过图位克隆的方法克隆了 S45A的恢复基因&1CYP704B，并通过进一步控制该基因的表达，繁殖甘蓝型油菜100%转基因不育系，突破了甘蓝型油菜核不育系杂交制种存在50%可育株的障碍，但目前还未在生产上推广。美国和加拿大利用烟草的1々四基因的启动子和核糖核酸水解酶(barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统用到的不育系和恢复系均为转基因材料，目前仍处于专利保护期内。9012A(陈凤祥等，1998)和 20118A (孙超才等，2004)均属于互作型核不育系，该不育系最大的优点是可通过引入临保系获得100%的不育系，在实现三系化配套时避免了制种过程中拔除50%可育株的麻烦， 在油菜核不育系统研究领域取得了重大进展。以其为材料选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”(陈凤样等，2002)、“皖油18号，(陈凤祥等，2003)和“沪油杂1号”(孙超才等，2004)等组合。陈凤祥等也由于这项重大的突破获得了 2007年度国家科技进步二等奖。由于该系统具有较大的应用潜力，但由于该系统应用的关键在于选育纯合不育系两型系与同型临保系，应用传统的杂交测交选育所需时间长，工作量极大。应用分子标记结合回交转育是目前用于对单基因控制或者几个基因控制的性状转育的快捷有效的办法。开发与不育基因连锁的分子标记用于该不育系统不育系与临保系的分子标记辅助转育，具有重要意义。目前对该系统控制育性的关键基因BnMs3与^irf(Bnesp)的研究较多，柯丽萍等(2005)、黄镇等(2007)、何俊平等(2009)先后实现了 BnMs3的初定位和精细定位，谢彦周等Q007)、肖麓等(2008)、徐正华等Q009)也先后对&irf (Bnesp)进行了相关研究。在定位的过程中开发了很多的分子标记，部分标记已被验证可以应用于标记辅助育种，但由于没有基因内的分子标记，在选择的效率和准确性上还存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目是在于提供了一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，控制甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因BnMs3与^irf(Bnesp)基因所在区段的核苷酸序列，该序列的获得与公布，将加快BnMs3与&irf两对基因的克隆，为从分子水平和代谢水平研究油菜隐性核不育育性控制机制奠定了基础，并为开发与这两个基因的功能标记和与之连锁的可用于分子标记辅助选择的标记提供了序列参考。本发明的另一个的目是在于提供了一种控制甘蓝型油菜隐性核不育育性基因区段的分子标记在甘蓝型油菜隐性核不育系与临保系分子标记辅助转育中的应用。这些基因区段IOKB物理距离以内的分子标记的应用，将使油菜隐性核不育系与临保系的分子标记辅助转育更快，更准，更有效。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施—种控制甘蓝型油菜隐性核不育育性的基因区段的核苷酸序列及分子标记的制备方法，其步骤是1、申请人所在单位通过对控制油菜隐性核不育基因BnMs3与&irf的初级定位与精细定位，分别将BnMs3与^irf(Bnesp)定位在甘蓝型油菜N19和N7连锁群上一段小于 0. 2cM的遗传区间内。2、通过标记筛选结合Southern杂交筛选Tapidor BAC文库，分别获得了包含 BnMS3 和 Bnrf 的目标克隆 JBnB043L23 与 JBnB089D05。3、通过目标BAC的局部测序(华大基因)和进一步开发标记与比较测序相结合的方法获得了 BnMs3与^irf(Bnesp)的候选基因区段的核苷酸序列。序列信息如下l)BnMs3基因区段的核苷酸序列为序列表中SEQ. 1中所示的DNA序列；2)Bnms3基因区段的核苷酸序列为序列表中SEQ. 2中所示的DNA序列；3)BnRf基因区段的核苷酸序列为序列表中SEQ. 3中所示的DNA序列；4)Bnrf基因区段的核苷酸序列为序列表中SEQ. 4中所示的DNA序列。4、根据步骤3所提供的BnMs3与等位隐性基因Bnms3基因区段核苷酸序列之间存在的差异以及&iRf与等位隐性基因&irf基因区段核苷酸序列之间存在的差异，分别开发设计引物，最终开发出BnMs3与&iRf两个不育基因区段的分子标记多对(表1)。表1 本发明在目标基因区段开发的SCAR分子标记特征
权利要求
1.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 GAGGGTTACAATGGAGGTAC/ CTTGCTATCTGAGAAACAACG。
2.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 GAGGGTTACAATGGAGGTAC/TATCAACCAAATAAACAATGATC。
3.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 ATCTCAAATCTTTCAGCTGATGA/GTTCTCTAATACTATATGCGATA。
4.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 GCGGTCACAAGAGGAGGTAA/CAGCCTCAATCCCAGTCTTC。
5.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 ACACAACTGTGCGGTTTTGTGACT/AGTACCCAGTTTCAGACAGCCTA。
6.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 CTCAAGAAGGCTGGTGCATCCGGA/TGGCTACTTCCCCAACAATCACT。
7.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 CTCAAGAAGGCTGGTGCATCCGGA/AAAGATAACCAAAACACACTCGG。
8.一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记，其特征在于所述的分子标记为 AGACATCATTGACGCTGCTG/TGAAGATCTTGTGTCTAGCAATG。
9.权利要求1至8任意一项所述的一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记在甘蓝型油菜隐性核不育系分子标记辅助转育中的应用。
10.权利要求1至8任意一项所述的一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记在甘蓝型油菜隐性核临保系分子标记辅助转育中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种油菜隐性核不育基因区段的分子标记与应用，其步骤A、通过对控制油菜隐性核不育基因BnMs3与Bnrf的定位，将BnMs3与Bnrf定位在甘蓝型油菜N19和N7连锁群上一段小于0.2cM的遗传区间；B、通过标记筛选结合Southern杂交筛选TapidorBAC文库，获得了包含BnMS3和Bnrf的目标克隆JBnB043L23与JBnB089D05；C、通过目标BAC的测序获得了BnMs3与Bnrf的候选基因区段的核苷酸序列；D、根据C步骤的BnMs3与等位隐性基因Bnms3基因区段核苷酸序列之间的差异以及BnRf与等位隐性基因Bnrf基因区段核苷酸序列之间的差异，开发设计引物，开发出BnMs3与BnRf不育基因区段的分子标记。分子标记在甘蓝型油菜隐性核不育系与临保系分子标记辅助转育中的应用，使油菜隐性核不育系与临保系的分子标记辅助转育更快，更准，更有效。
文档编号C12Q1/68GK102286474SQ20111013689
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者李季, 杨光圣, 洪登峰, 董发明 申请人:华中农业大学