专利名称：甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系的分子标记与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于甘蓝型油菜隐性核不育基因的分子标记制备领域，具体涉及到与育性 相关基因连锁的分子标记制备及其在甘蓝型油菜中与不育系同源的临保系的标记辅助选 育等方面的应用。
背景技术：
雄性不育是油菜杂种优势利用的有效途径。到目前为止，利用细胞质雄性不育进 行的三系化杂交制种依然是甘蓝型油菜杂种优势利用的最主要途径。以pol CMS和陕2A CMS为代表的细胞质雄性不育已大量用于杂交种生产。细胞核雄性不育是油菜杂种优势利 用的一条重要途径，特别是隐性细胞核雄性不育表现出一些优于细胞质雄性不育的特性 不育性彻底、稳定；具有广泛的恢复源；不存在不育胞质负效应和细胞质单一化的风险。因 此，细胞核雄性不育在油菜杂种优势的利用中显示出巨大的应用潜力，已成为油菜杂种优 势利用的一个研究热点。然而，细胞核雄性不育在杂交制种的过程中，不能产生100%的全 不育群体，必须拔除母本行中50%的可育株，给制种生产带来很大不便，因此全不育群体的 发展成为细胞核雄性不育广泛用于油菜杂种生产的关键。7-7365AB是一类新型隐性细胞核雄性不育材料，其育性受到1对隐性不育基因 (Bnms3)和1对复等位上位基因(BnMs4/Bnrf)控制。当Bnrf基因为隐性纯合或BnMs4基 因显性纯合或杂合时可以抑制纯合不育基因(Bnms3)的正常表达，从而使育性得到恢复。 因此，基因型为Bnms3ms3Ms4_禾口 Bnms3ms3rfrf的单株表现可育，而基因型为Bnms3ms3RfRf 和BnmS3mS3Rfrf的单株则表现不育。因此，该材料可以模拟细胞质雄性不育实现三系化制 种(图1)纯合两型系(AB系，基因型:Bnms3ms3RfRf和BnMs3ms3RfRf)，临保系(C系，基 因型Bnms3ms3rfrf)，恢复系(R系，基因型BnMs3Ms3_* Bn_Ms4Ms4)。即利用不育系与临 保系杂交产生100%的不育群体，再利用该全不育群体与恢复系生产杂交种，从而解决了该 隐性核不育在杂交制种中的须拔除母本行50%可育株的难题。该遗传模式目前尚未见报 道。由于涉及到1对隐性不育基因及1对复等位上位基因，因此细胞核雄性不育临保 系的选育难度较大。因此，发展与BnMS3、BnMS4和BnRf三个基因连锁的分子标记对于纯合 两型系，尤其是与纯合两型系同源的临保系的选育尤为重要。AFLP技术(Vos et al,1995) 因其诸多优点而被广泛用于多种作物的重要农艺性状基因的定位、遗传连锁图的构建以及 遗传多样性分析中(Jorge et al, 1999 ；Tang et al,2006 ；Zhang et al,2006 ；Price et al，2000 ；Guo et al，2003)。AFLP结合BSA分析法更能直接针对目标基因所在区段，使标 记的获得更加快速和准确。因此，该方法广泛用于各种基因的定位研究(Yi et al,2006； Lei et al，2007 ；Ke et al，2005)。Hong 等(Hong et al，2006)利用该方法在显性核不育 材料Rsl046AB中得到了 6个与显性抑制基因Rf连锁的AFLP标记，Huang等(Huang et al， 2007)通过筛选1024对引物组合，得到15个与BnMs3连锁的AFLP标记；Xiao等(Xiao et al，2008)筛选得到7个与BnRf连锁的AFLP标记，并将BnRf定位到N7连锁群上端。本发明利用类似的方法获得了 8个重要的分子标记，为分子标记辅助选择(MAS)在甘蓝型油菜 中的应用提供了极大的便利，为甘蓝型油菜隐性上位互作细胞核雄性不育系临保系的选育 提供了快速有效的途径
发明内容
本发明的目的是提供一种与甘蓝型油菜隐性核不育育性相关基因连锁的分子标 记，及其在甘蓝型油菜分子标记辅助选择中的应用，其中包括与甘蓝型油菜不育系同源的 临保系的标记辅助选育等方面。本发明通过以下技术方案实现一种与甘蓝型油菜隐性上位互作核不育相关的BnMs3，BnMs4和BnRf基因紧密连 锁的分子标记，所述的分子标记用于鉴定甘蓝型油菜在所述三个基因位点的基因型，同时 用于利用该隐性细胞核雄性不育进行分子标记的辅助选择，其特征在于，它是下列分子标 记之一(1)与 BnMs3 基因紧密连锁的用于区分 BnMs3ms3RfRf、BnMs3Ms3RfRf 禾口 Bnms3ms3RfRf三种基因型的共显性SSR分子标记SR12384，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 11-12所示；(2)与BnRf基因紧密连锁的用于区分Bnms3ms3rfrf、Bnms3ms3Rfrf禾口 Bnms3ms3RfRf三种基因型的共显性SSR分子标记D1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO :13_14 所示；(3)与BnMs4基因紧密连锁的显性SCAR分子标记SMl29、SM98和SMl 13，它的 核苷酸序列如SEQ ID NO 1-6所示，以及与BnMs4基因连锁的用于区分Bnms3ms3rfrf、 Bnms3ms3Rfrf和Bnms3ms3RfRf的三种基因型共显性分子标记SM25和H3，它的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 7-10 所示。本发明的分子标记可以在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育标记辅助选择中得到 应用。本发明的分子标记还可以在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育基因BnMs3，BnMs4 和BnRf精细定位和图位克隆中得到应用。申请人:提供了一种与甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育基因紧密连锁的分子标记 的制备方法，该方法按照以下步骤(1)与BnMs3基因连锁的共显性SSR分子标记SR12384的制备a)利用甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育的两型系7-7365AB中基因型为 BnMs3ms3RfRf的可育株和基因型为Bnms3ms3RfRf的不育株进行至少10代的兄妹交得到 BnMs3位点的近等基因系，将其命名为7-7365AB ；b)采用CTAB小量法提取上一步骤a)中不育株和可育株DNA，用如序列表SEQ ID NO: 11-12所示的引物PCR扩增可育单株和不育单株的DNA;c)利用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果，得到可以区分三种基因型 BnMs3ms3RfRf、BnMs3Ms3RfRf 和 Bnms3ms3RfRf 的共显性 SSR 分子标记 SR12384，其序列如 SEQ ID NO 11-12 所示。(2)与BnRf基因连锁的共显性SSR分子标记Dl的制备
a)利用甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系7-7365AC中基因型为Bnms3ms3rfrf的 可育株和基因型为BnmS3ms3Rfrf的不育株进行至少10代的兄妹交得到得到BnRf位点的 近等基因系，将其命名为7-7365AC ；b)采用CTAB小量法提取上一步骤a)中不育株和可育株DNA，采用集团分析法，用 如序列表SEQID NO 13-14所示的引物PCR扩增可育单株和不育单株的DNA ；c)利用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果，得到可以区分三种基因型 Bnms3ms3rfrf、Bnms3ms3Rfrf 禾口 Bnms3ms3RfRf 的共显性 SSR 分子标记 D1，其序列如 SEQ ID NO 13-14 所示。(3)与BnMs4基因连锁的SCAR分子标记SM129、SM98、SM113、SM25和H3的制备a)利用甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系7-736512AB中基因型为 Bnms3ms3Ms4Rf的可育株和基因型为Bnms3ms3RfRf的不育株进行至少10代的兄妹交得到 得到BnMs4位点的近等基因系，将其命名为7-736512AB ；b)采用CTAB小量法提取上一步骤a)中不育株和可育株DNA，采用集团分析法，用 如序列表SEQID NO 1-10所示的引物PCR扩增可育单株和不育单株的DNA ；c)利用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果，得到与BnMs4连锁的显性分 子标记SM129、SM98和SM113，其序列如SEQID NO :1_6所示；以及可以区分三种基因型 Bnms3ms3rfrf、Bnms3ms3Rfrf 和 Bnms3ms3RfRf 的共显性分子标记 SM25 和 H3，其序列如 SEQ ID NO 11-14 所示。上述步骤a)中所述CTAB小样法如下将幼嫩植株或叶片放入研钵中加 0. 75-1. 0ml CTAB抽提缓冲液，立即用研磨棒将其捣碎成勻浆，再移入2. OmL离心管中，然 后在55°C -60°C水浴45-60min，其间轻轻地上下摇动，取出离心管冷却至室温，再加等体积 的体积比为24 1的氯仿异戊醇充分混勻10-20min, 12000r/min离心12_15min，转移上 清液到另一个2. OmL离心管中，在装有上清液的离心管中加入60U15mmol/LNH4AC，然后再加 入2倍体积的预先冰冻的无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，在_20°C放置l_2hrs或过夜，用枪头 挑出或10000r/min离心3min沉淀DNA，再用含10mM NH4Ac 70%乙醇氨浸泡DNA 5hrs,除 去乙醇溶液，在室温下或通风橱中干燥DNA，再加300 ill TE缓冲溶液或300 ill ddH20溶解 DNA, -20°C保存备用；其中CTAB抽提缓冲液成份为(按体积百分比)2%CTAB，1. 4M NaCl,20mM EDTA，0. 2% 3巯基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8. 0，加水定容至1L ；TE缓冲溶液配制方法如下500ml TE缓冲液中含10mM Tris-HCl和ImM EDTA-Na2，pH 8. 0，121°C灭菌后室温保存。表1.本发明的引物序列 本发明的积极效果1.分离得到了与BnMs3、BnMs4和BnRf基因紧密连锁的分子标记，构建了 BnMs3位 点和BnMsVBnRf位点的高密度的遗传连锁图谱，为以上3个基因的进一步精细定位和克隆 奠定了良好的基础。2.获得了大量的分子标记，尤其是以PCR为基础的共显性SCAR标记以及SSR标 记，为利用分子标记进行隐性上位互作核不育纯合两型系及其临保系的辅助选育提供了必 要的条件，方便了隐性核不育材料的杂种优势利用，为杂交种的生产提供了良好的条件。更详细的技术方案如《具体实施方式
》所述。
图1.甘蓝型油菜隐性上位互作核不育7-7365AB “三系化”制种模式图。图2.甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育基因BnMs3的分子标记遗传连锁图。图3.与BnMs3基因连锁的共显性标记sR12384在小群体中的扩增图。图4.与BnRf基因连锁的标记连锁图。图5.与BnRf基因连锁的共显性SSR标记Dl在小群体中的扩增图
图6.与BnMs4连锁的SCAR标记在小群体中的扩增。图中A :SM129, B :SM98, C :SM113 ；图7. (a)由TapidorXNingyou7构建的N7连锁图图示EC09MG12被定位在XMl 和CNU063之间，方框中XMl为与BnRf基因连锁的AFLP标记，被定位在N7上端。(b)由近 等基因系7-736512AB构建的BnMs4基因的遗传连锁图图示与BnMs4连锁的13个AFLP标 记，4个SCAR标记，5个与BnRf基因共同的分子标记，虚线示意两连锁图中共同的分子标 记。(c)由近等基因系7-7365AC构建的BnRf基因的遗传连锁图图示BnRf基因位于通用 标记ENA06和SSRl之间。(d)来自QuantumXNo2127_17的N7遗传连锁图图示P16MC08 被定位到ME7EM12E和sR4047之间。图8. (a)SCAR标记SM25在不同基因型单株中的垂直电泳扩增图。(b)SSR标记Dl 在不同基因型单株中的垂直电泳扩增图。(c) SCAR标记H3在不同基因型单株中的垂直电泳 扩增图。1 近等基因系7-736512AB中基因型为Bnms3ms3Ms4Rf的可育单株2 近等基因系7-736512AB中基因型为Bnms3ms3Ms4Ms4的可育单株3 近等基因系7-736512AB中基因型为Bnms3ms3RfRf的不育单株4 近等基因系7-7365AC中基因型为Bnms3ms3Rfrf的不育单株5 近等基因系7-736512AB中基因型为Bnms3ms3RfRf的不育单株
6 近等基因系7-7365AC中基因型为Bnms3ms3rfrf的可育单株图9.分子标记辅助选择在选育甘蓝型油菜隐性核不育临保系中的应用
具体实施例方式实施例1 甘蓝型油菜隐性上位核不育相关基因BnMs3，BnMs4和BnRf特异性分子 标记的获得1.三个近等基因系群体7-7365AB，7-736512AB和7-7365AC的构建所用的基本材料为甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育纯合两型系 7-7365AB(Bnms3ms3RfRf/BnMs3ms3RfRf)(Huang et al，2007)、新型甘蓝型油菜 7-749 (Bnms3ms3Ms4Ms4)(黄镇，博 士 论文，2008，http //www. cnki. net/)及其临保 系7-7365C (Bnms3ms3rfrf) (Xiao et al，2008)，由该三个材料得到三个近等基因系 7-7365AB (Huang et al，2007)，7-736512AB (黄镇，博士论文，2008，中国知网，http //www. cnki. net/)和 7-7365AC) (Xiao et al，2008)，分别用于与 BnMs3，BnMs4 和 BnRf 这三个基 因紧密连锁的分子标记的筛选。近等基因系7-7365AB的构建用纯合两型系7-7365AB中的不育株 (Bnms3ms3RfRf)和可育株(BnMs3ms3RfRf)进行10代以上的杂交保存，最终获得单株之 间的差异仅存在于Bnms3位点及附近区域的近等基因系7-7365AB(Huang et al，2007)。 7-7365AB 包括 50% 的不育单株(Bnms3ms3RfRf)和 50% 的可育单株(BnMs3ms3RfRf)。播 种该7-7365AB，本专业的技术人员利用肉眼就能鉴别不育株和可育株。近等基因系7-736512AB的构建由7-7365A(Bnms3ms3RfRf)与新型甘蓝型油 菜7-749 (BnmS3mS3MS4MS4)杂交，然后与7-7365A回交，其后代出现不育与可育的分离， 利用与BnMs3紧密连锁的分子标记SR12384扫描可育单株获得基因型为BnmS3mS3MS4Rf 的单株后代，然后该可育单株与不育单株进行连续杂交建成单株之间的差异仅存在于 BnMs4位点及附近区域的近等基因系群体7-736512AB (黄镇，博士论文，2008，http //Ww. cnki.net/)。7-736512AB中包括50 %的不育单株(Bnms3ms3RfRf)和50%的可育单株 (Bnms3ms3Ms4Rf)。播种该7-736512AB，本专业的技术人员利用肉眼就能鉴别不育株和可育 株。近等基因系7-7365AC的构建利用7-7365A与7-7365C杂交得到的再与 7-7365A进行回交得到BCi分离群体(Bnms3ms3Rfrf/Bnms3ms3rfrf)。用该BQ群体内 部的可育株和不育株进行杂交10代以上，获得单株之间的差异仅存在于BnRf位点及附 近区域的近等基因系7-7365AC(Xiao et al，2008)。7-7365AC中包括50 %的不育单株 (Bnms3ms3Rfrf)和50%的可育单株(Bnms3ms3rfrf)。播种该7-7365AC，本专业的技术人 员利用肉眼就能鉴别不育株和可育株。2. DNA提取及样品池的构建对三个近等基因系群体中各自的不育单株和可育单株挂牌，于苗期选取0. 5g鲜 嫩叶片，装于2.0ml离心管，于-20°C或-70°C储存备用。基因组DNA提取采用CTAB法 (Lu et al，2004)。具体步骤是将近等基因系群体甘蓝型油菜叶片倒于研钵中，加入 700-800 u 12 % 的 CTAB 缓冲液(2 % CTAB ；EDTA20mmol/L ；pH = 8. 0Tris-HC1100mmol/L ； NaC11.4mol/L;PVPl% )，磨成勻浆。65 °C水浴60min，每隔15min轻摇一次。室温放置 lOmin，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)轻摇，混勻。12，000r/min离心15min，轻轻取
7出，吸取上清至新的2ml的离心管中，加1/10体积的3M NaAC (PH = 5. 2)，再加入两倍体积的冰冻无水乙醇，上下翻转数次混勻，冰浴30min。10，000r/min离心2min，小心的倒去上 清，加1，000 μ 1漂洗液(76%乙醇，IOmM醋酸铵)，漂洗两次。小心的倒掉漂洗液，于室温 下晾干至透明无色。视DNA量，酌情加入TE缓冲液(含0. 1 %的RNase)溶解DNA，-20°C 保存备用。总DNA质量用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。总DNA浓度用紫外分光光度计 (Pharmacia Biotech, Gene QuantII)测量，根据检测结果，将各样品的DNA浓度用ddH20调 整到50ng/l·! 1，于-20°C保存备用。根据花期育性调查的结果，从三个近等基因系中各自选取16个可育单株和16个 不育单株，8个单株DNA等量混合，分别构建2个可育池(BF)和2个不育池(BS)。3. AFLP 与 BSA 分析3. 1总DNA的酶切和连接同时分析两个可育池和两个不育池，以提高筛选效率。反应体系为总DNA 75ng, 2.5U EcoR 1(或PstI、Sac I)，1. 5U Mse I(MBI Fermentas,Lithuania),1Xbuffer Tango, 总体积为12. 5 μ 1。先在37°C温浴5. 5-6h，后转入65°C水浴lh，酶切完成后加入等体积的 连接混合液(0.75U T4 DNA 连接酶，25pmol EcoRI 或 Pst I 或 Sac I 接头，25pmol Mse I 接头)，于4°C冰箱过夜。连接完成后，用ddH20稀释10倍作为PCR预扩增的模板。本研究 的 AFLP 分析中共采用了 3 种酶切组合 EcoR I/Mse I,Pst I/Mse I 和 Sac I/Mse I。AFLP 接头和引物设计均按Vos等(1995)报道的方法进行，由上海生工生物工程技术有限公司合 成，序列信息如下表所示表2. AFLP接头及预扩增引物 3. 2预扩增本研究共采用10 种预扩增引物组合EA/MC，EA/MG，EC/MG，EC/MC，EC/PO, EC/TG， PO/MC, PO/MG, SA/MC, SA/MG。PCR反应体系5 μ 1酶切连接产物，1倍(X)PCR缓冲液，2. Ommol/L MgCl2, 0. 16mmol/L dNTPs, IU Taq 酶 50ng EA (或 P0、SA、EC)引物，50ng MC (或 MG、TG)引物，反 应总体积为25μ 1。PCR反应循环参数94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共进行20个循环。 取5μ 1 PCR产物于1. 0%琼脂糖凝胶检测，若呈弥散状(Smear，50bp-1000bp)，表明预扩增 效果则好。剩余产物稀释15-30倍，作为选择性扩增的模板。3. 3选择性扩增PCR反应体系3μ 1预扩增稀释产物，1倍(X)PCR缓冲液，2. Ommol/L MgCl2, 0. 2mmol/L dNTPs, IU Taq 酶，50ng E+3 引物(P0+3 引物，M+3 引物，T+3 引物或 S+3 引 物)(上述引物组合见表3及备注)，反应总体积为15 μ 1。PCR循环参数为94°C (30s), 65 "C (-0. 7 °C / 循环)(30s)，72 °C (lmin)，14 个循环；94 °C (30s), 56 °C (30s), 72°C (lmin) 25个循环。选择性扩增引物序列和编号见下表表3. AFLP选择性扩增弓丨物EcoRI (EA) E+3引物序 歹丨J
EcoRI (EC) E+3引物序 歹丨J
PstI (PO) P+3引物序 列
SacI (SA) S+3引物序 列
Msel (MC) M+3引物序 列
Msel (MG) M+3引物序 歹ij
Taql (TG)
T+3引物序 歹ij
1AAA1CAA1AGA1AAA1CAA1GAA1GAA2AAT2CAT2AGT2AAT2CAT2GAT2GAT3AAC3CAC3CAC3AACJCAC3GAC3GAC4AAG4CAG4CAG4AAG4CAG4GAG4GAG5ATA5CTA5CCA5ATA5CTA5GTA5GTA6ATT6CTT6CTG6ATT6CTT6GTT6GTT7ATC7CTC7GCA7ATC7CTC7GTC7GTC8ATG8CTG8GCT8ATG8CTG8GTG8GTG9ACA9CCA9GGA9ACA9CCA9GCA9GCA10ACT10CCT10GGT10ACT10CCT10GCT10GCT11ACC11CCC11GTT11ACC11CCC11GCC11GCC12ACG12CCG12TGA12ACG12CCG12GCG12GCG13AGA13CGA13TGT13AGA13CGA13GGA13GGA14AGT14CGT14TGC14AGT14CGT14GGT14GGT15AGC15CGC15ACA15AGC15CGC15GGC15GGC16AGG16CGG16ACT16AGG16CGG16GGG16GGG
基 EDTA，0
备注E+3 其中E表示5' -GACTGCGTACCAATTC-3 ‘加上表3中对应列的三个碱
P+3 其中 P 表示5 ‘-GACTGCGTACATGCAG-3 ‘
S+3 其中 S 表示5 ‘-GACTGCGTACAAGCTC-3 ‘
M+3 其中 M 表示5 ‘-GATGAGTCCTGAGTAA-3 ‘
T+3 其中 T 表示5 ‘-GATGAGTCTGTCACGA-3 ‘
加上表3中对应列的三个碱基 加上表3中对应列的三个碱基 加上表3中对应列的三个碱基 加上表3中对应列的三个碱基
3. 4扩增产物的电泳检测
在选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98%去离子甲酰胺，10mM/L 005%二甲苯青FF，0. 005%溴酚蓝)，95°C变性5min后立即冰浴冷却，上样2 yl， 80W电泳，当二甲苯青FF跑过2/3胶板时终止电泳。电泳后硝酸银染色显影。3. 5电泳检测结果通过筛选AFLP弓丨物，获得了与BnMs3连锁的17个AFLP标记，与BnMs4连锁的 13AFLP标记，与BnMs4连锁的12个AFLP标记这些标记的序列信息如下表所示 表4. nMs3基因连锁的AFLP标记
表5.BnMs4基因连锁的AFLP标记 表6.与BnRf基因连锁的AFLP标记 4. SCAR标记转化4. 1差异片段的回收与纯化在6%变性聚丙烯酰胺凝胶胶板(银染法)尚未干燥之前，或将干胶用ddH20湿润， 将不育单株中出现的特征片段用刀片轻轻挖下并转入加有20 u 1 dd^O的0. 5ml离心管中， 用一次性无菌枪头捣碎，于95°C保温lOmin后放于4°C备用，用前稍加离心。取2 yl上清液 做模板，再扩增的引物及反应条件与AFLP选择性扩增的反应条件完全相同。PCR完成之后 将产物置于72°C保温lOmin。取20 yl反应产物于1. 0%琼脂糖凝胶上检测，若扩增产物大 小与原来一致且无杂带，则用试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)回收主带。具体 过程如下用刀片于紫外灯下精确切出包含有目标片段的胶块，放入到1. 5ml离心管中，加 入500iU Binding Buffer，50°C 60°C保温lOmin，每隔两分钟上下翻转混勻，使胶彻底熔 化；然后将熔化的胶溶液转移到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，室温静置2min ；8000r/ min离心lmin，倒去收集管中的废液，在UNIX-10柱中加入500iil Washing Solution，室温 8000r/min离心lmin，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液；室温 12000r/min离心15s。在UNIQ-10柱中加入ElutionBuffer 30 u 1 (准确滴到过滤膜上)， 室温放置2min，插入到一个新的1. 5ml离心管中，12000r/min离心lmin，所收集溶液可用于 连接反应。4. 2连接反应采用pMD18-T vector试剂盒(TaKaRra)进行目标片段的克隆。连接体系为2 u 1 DNA,0. 5u 1 pMD18-Tvector,2. 5u 1 solution I。短暂离心收集混合物，于 4°C连接过夜。4. 3大肠杆菌(Ecoli)感受态细胞的制备取保存于-70°C的大肠杆菌菌株DH-5ci菌液，首先在LB固体培养基上分离单克 隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取0. 5ml菌液转接于装有45ml LB液体培 养基的三角瓶中，于摇床培养2. 5 3h(37°C，240r/min)，后转移至预冷的50ml离心管中， 冰浴lOmin，低温离心10min(4°C,4000r/min)收集菌体，加入2ml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬培养物，冰浴15min，4°C 4000r/min离心lOmin，去上清液，倒立晾干，再加2ml预冷的0. lmol/L CaCl2重悬细胞，分装于冰浴的无菌微量离心管中，加甘油混勻后放入_70°C冰箱 保存备用。4. 4连接子的转化取2 μ 1连接反应物转入1. 5ml离心管中，冰浴待用。从_70°C冰箱中取出感受态 细胞置于冰上，待其刚好融化时(约5min)小心吸取50 μ 1细胞转入到上面的离心管中，冰 上静置20min。42°C水浴中准确热激90s(勿摇动)。迅速放回冰上2min，然后加入LB培养 基(室温)400μ 1，37°C摇床培养1.5h(150r/min)。从中取转化培养液100 μ 1平铺于LB 平板(Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L NaCl 10g/L, Agar 15g/L, Amp50 μ g/mL)上， 正置平板至液体全部被吸收，然后倒置平板于37°C培养16h 20h使蓝、白斑充分呈现。4. 5重组子的筛选与鉴定每一个目标克隆片段，各挑选6个白色单克隆菌落进行液体培养。用通用测序 引物 M13 (来源于 PMD-18 载体序列，M13-47 5 ‘ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ‘ RV-M 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ‘)对菌液进行PCR检测，反应体系为2 μ 1菌液，1 倍(X)PCR 缓冲液，1. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTPs, 1. OU Taq 酶(MBI Fermentas), 通用测序引物各35ng，反应总体积为20μ 1。PCR循环参数为94°C (2min) ； 94 °C (30s), 55 °C (30s),72°C (60s)，30个循环；4°C保存。产物于1. 2%琼脂凝胶电泳检测，若扩增片段 大小与原来目的片段大小相当(或稍大)，则说明为阳性单克隆。每个特异片段送2个克隆 到北京奥科生物技术有限责任公司测序。4. 6SCAR 引物设计根据测序结果，利用引物设计软件Primer 3设计引物，由北京奥科生物技术有限 责任公司合成。4. 7SCAR 标记分析特异PCR 扩增的反应体系为50ng DNA，1 倍(X)PCR buffer, 2. Ommol/L Mg2+， 0. 15mmol/L dNTPs, 1. OU Taq polymerase，正、反向特异引物各50ng，反应总体积为 20 μ 1。 PCR 循环参数为-MV (2min) ；94°C (30s)，最优退火温度(Imin)，72°C (Imin)，35 个循环。 先用双亲做温度梯度试验，确定适宜的退火温度范围，退火和延伸的时间依片段长度另作 调整。扩增产物在1.2%琼脂凝胶上电泳检测。如果在亲本间检测到多态性，则对分离群体中各单株进行PCR扩增和电泳检测。 如没有多态性可考虑重新设计引物，仍没有则实施PCR步行，将标记位点的侧翼序列克隆 出来。最终获得了与BnMs3基因连锁的5个SCAR标记(表7)以及与BnMs4连锁的3个显 性SCAR标记SM129、SM98、SM113 (图7)和两个共显性SCAR标记SM25和H3 (图8A，图8C)， 它们的序列如序列表SEQ ID N0:l-10所示。表7.与BnMs3基因连锁的SCAR标记 5. BnMs3基因位点和BnMS4/BnRf基因位点遗传图谱的构建及其图谱定位将与各个基因紧密连锁的的分子标记名称和形态性状的统计数据输入计算机，运 行MAPMAKER/EXPVersion 3. 0软件分析作图，得到3个基因的遗传连锁图谱(图2，图4，图 5)。利用2 个双单倍体(DH)群体 TapidorXNingyou7(Qiu et al，2006)和 QuantumXNo2127-17(Chen etal，2007)将与 BnMs3 连锁的 AFLP 标记 P06MG04 定位于已 经发表的甘蓝型油菜的N19连锁群上，并且在N19上获得了 1个能够区分BnMS3mS3RfRf/ BnMs3Ms3RfRf/Bnms3ms3RfRf三种基因型的共显性SSR分子标记sR12384 (图3)，该SSR标 记的序列如序列表SEQ ID NO 11-12所示。与BnRf连锁的AFLP标记P01MC07也被定为在 N7连锁群的上端，筛选获得1个能够区分Bnms3ms3Rfrf/Bnms3ms3RfRf/Bnms3ms3rfrf三种 基因型的共显性SSR分子标记D1，该SSR标记的序列如序列表SEQ ID NO 13-14所示，同 样利用这2个双单倍体群体将与BnMs4连锁的AFLP标记P19MC08和EC09MG12定位在N7 连锁群的上端，并在N7上获得了与BnMs4和BnRf都连锁的共同的分子标记ENA06，CNU063 和SR4047，并且发现SM25和D1也为共同的分子标记(图8A，图8B)。6. SSR分析体系PCR 反应体系50ng DNA，1 XPCR 缓冲液，2. Ommol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTPs, 0.5U Taq酶，正向及反向SSR引物各12.5ng，反应总体积为lOiU。PCR循环参数为 94°C (2min) ；94°C (30s)，60°C (-0. 5°C / 循环)(30s)，72V (45s)，14 个循环；94°C (30s)， 55°C (30s)，72°C (lmin)，30个循环；4°C保存。扩增产物于6%变性PAGE凝胶上电泳分离， 通常用0. 5XTBE,80ff电压。电泳完成后，银染法显带。实施例2 利用甘蓝型油菜隐性核上位不育与BnMS3/BnMS4/BnRf连锁的共显性分
子标记选育优良的临保系与改良后不育系同源的临保系选育的技术路线如下(图9)
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1.利用隐性上位互作细胞核雄性不育纯合两型系中的不育单株 7-7365A(Bnms3ms3RfRf)与临保系7-7365C (Bnms3ms3rfrf)杂交,得到一个全不育群体,将 其命名为 S1(BnmsSmsSRfrf)代。2.利用得到的S1代单株与纯合两型系中的可育单株7-7365B(BnMS3ms3RfRf)进 行杂交，获得一个分离群体，我们将其命名为S2代。3. S2 代中包含 4 种基因型(BnMs3ms3Rfrf、BnMs3ms3RfRf、Bnms3ms3Rfrf 禾口 Bnms3ms3RfRf)，利用与BnMs3和BnRf紧密连锁的显性及共显性标记筛选目标基因型为 BnMs3ms3Rfrf的个体(定义为候选单株)。同时对于筛选得到的单株利用AFLP技术进行 背景选择，选择与7-7365A背景最为接近的单株。4.将上一步中得到的候选单株与7-7365A进行杂交，得到一个分离群体，将其命 名为S3代。在S3代中，同样利用与BnMs3和BnRf紧密连锁的显性及共显性标记筛选目标 基因型为BnMS3mS3Rfrf的个体。同时对于筛选得到的单株利用AFLP技术进行背景分析， 选择与7-7365A背景最为接近的单株。5.将上一步中得到的候选单株分别进行自交，得到的分离群体命名为S4代。 在、代中，我们利用与BnMs3、BnRf紧密连锁的显性及共显性标记筛选目标基因型为 Bnms3ms3rfrf 的个体。6.在每一个分离世代中，进行前景和背景选择。最终选育出农艺性状优良并且品 质较好的临保系参考文献[1]VosPiHogers RiBleeker MiReijans M,van de Lee TiHornes MiFreijters A， Pot JiPeleman JiKuiper Μ,Zabeau Μ. AFLP :A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research，1995，23 :4407_4414.[2]Jorge L FiFabio EiAlba AiGeraldo GiMiriam C DiMirle FiJuan E DiJoe M T. Analyses of geneticdiversity in Cuban rice varieties using isozyme,RAPD and AFLP markers. Euphytica，1999，109 :107_115.[3] Tang S Q，Bin X Y，Wang L，Zhong Y. Genetic diversity and population structure of yellow camellia(Camellia nitidissima) in China as revealed by RAPD and AFLP markers. Biochemical Genetics，2006，9 :444_456. Zhang Z F, Wang Y，Zheng Y LAFLP and PCR—based markers linked to Rf3, a fertility restorergene for S cytoplasmic male sterility in maize. Molecular Genetics and Genomics，2006，2 162-169.[4] Price A H，Steele K AiMoore B JiBarraclough P PiClark L J. A combined RFLP and AFLP linkage map ofupland rice (Oryza sativa L)used to identify QTLs for root-penetration ability. Theoretical and AppliedGenetics,2000,1 :49_56.[5] Guo P G，Bai G H，Shaner G E· AFLP and STS tagging of a major QTL for Fusarium head blight resistancein wheat. Theoretical and Applied Genetics，2003， 106 :1011-1017.[6] Yi B，Chen Y N，Lei S L，Tu J X，Fu T D. Fine mapping of the recessive genie male-sterile gene (Bnmsl)inBrassica napus L. Theoretical and Applied Genetics，2006，113 :643_650.
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权利要求
一种与甘蓝型油菜隐性上位互作核不育相关的BnMs3，BnMs4和BnRf基因紧密连锁的分子标记，所述的分子标记用于鉴定甘蓝型油菜在所述三个基因位点的基因型，同时用于利用该隐性细胞核雄性不育进行分子标记的辅助选择，其特征在于，它是下列分子标记之一(1)与BnMs3基因紧密连锁的用于区分BnMs3ms3RfRf、BnMs3Ms3RfRf和Bnms3ms3RfRf三种基因型的共显性SSR分子标记SR12384，它的核苷酸序列如SEQ ID NO11-12所示；(2)与BnRf基因紧密连锁的用于区分Bnms3ms3rfrf、Bnms3ms3Rfrf和Bnms3ms3RfRf三种基因型的共显性SSR分子标记D1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO13-14所示；(3)与BnMs4基因紧密连锁的显性SCAR分子标记SM129、SM98和SM113，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1-6所示，以及与BnMs4基因连锁的用于区分Bnms3ms3rfrf、Bnms3ms3Rfrf和Bnms3ms3RfRf的三种基因型共显性分子标记SM25和H3，它的核苷酸序列如SEQ ID NO7-10所示。
2.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育标记辅助选择中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育基因BnMS3，BnMS4和 BnRf精细定位和图位克隆中的应用。
全文摘要
本发明属于油菜分子标记制备领域，具体涉及甘蓝型油菜隐性核不育基因连锁的分子标记及与核不育系同源的临保系的选育。特征是，以甘蓝型油菜雄性不育两型系7-7365AB、甘蓝型油菜7-749和临保系材料7-7365C为材料构建了BnMs3，BnMs4和BnRf三个基因的近等基因系7-7365AB，7-736512AB和7-7365AC，通过筛选SSR引物和AFLP引物及转化SCAR标记，得到了与BnMs3连锁的共显性SSR分子标记SR12384；与BnMs4连锁的显性SCAR标记SM129、SM98、SM113及共显性SCAR标记SM25和H3；与BnRf连锁的共显性SSR标记D1。可用于该隐性核不育的标记辅助选择和育种，还可用于不育基因的精细定位和克隆中。
文档编号C12Q1/68GK101880658SQ201010153408
公开日2010年11月10日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者俎峰, 傅廷栋, 夏胜前, 文静, 易斌, 李兴华, 沈金雄, 涂金星, 肖麓, 马朝芝, 黄镇 申请人:华中农业大学