一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法
【专利摘要】本发明公开了一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，以抗根肿病的甘蓝为母本与抗根肿病的小白菜杂交，F1代授粉15天后，挑选种子进行胚挽救，利用含2％的蔗糖的B5液体培养基培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2％蔗糖的B5固体培养基上，3?4叶期时利用0.1％的秋水仙素处理2小时进行加倍，漂洗干净后移至土壤中，利用剥蕾授粉或者花期喷施盐水的方法使合成的植株自交；自交的种子在发芽期，利用根肿病P4生理小种接种，同时以感病的材料作为对照，同时接种，35天后，取出幼苗的根，洗净观察是否有肿块，没有肿块说明合成的植株具有根肿病抗性。本发明提供了一条选育抗根肿病甘蓝型油菜的品系有效途径，提高了根肿病接种效率。
【专利说明】
一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法
技术领域
[0001]本发明涉及甘蓝型油菜人工合成技术领域，具体是一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法。
【背景技术】
[0002]根肿病是由芸薹属根肿菌(Plasmod1phora brassicae)引起的一种真菌病害，现分布于全世界，温带地区发病情况尤为严重。1995年，我国首次报道了油菜根肿病，随后该病在全国大面积蔓延，目前大部分省、市、自治区均有分布，但主要分布在云南、四川、贵州、湖北、安徽、陕西南部等地。该病菌侵染和危害几乎所有的十字花科植物，特别是芸薹属植物，如白菜、甘蓝等(Piao等，2009) ο油菜根肿病自苗期开始发生，主要侵染根部，造成植株生长迟缓，叶片变黄，植株矮化，并表现缺水，严重时幼苗枯死。成株期感病肿瘤多发生在侧根和主根的下部，后期肿瘤龟裂而且粗糙，最后腐烂，严重影响了水分和养分的正常吸收，从而造成油菜严重减产或者绝收。据研究报道油菜根肿病苗期发病率达17%，成株期田间平均发病率为15%，一般造成减产10%-20%，严重田块减产50%以上(陶学军，2015)。在我国，根肿病常年危害面积约320-400万公顷，占十字花科作物种植面积的1/3以上，大流行年份发生与危害面积可达900万公顷(王靖等，2008)。
[0003]十字花科根肿病存在多个生理小种，在我国，甘蓝型油菜根肿病病原至少存在2号、4号和13号等3个生理小种类型，其中4号小种存在的范围最广泛。在国外，如加拿大，具有2、3、5、6、8等至少5个生理小种，其中主要为3号生理小种。由于不同的生理小种所对应的致病基因不尽相同，在某一地区抗根肿病的品种种植到另外的区域后，常常由于生理小种发生改变而导致原来的抗根肿病品种变为感根肿病的品种，这给根肿病的防治带来极大的困难。此外，由于现有的一些十字花科材料抗性比较单一，多年种植后其抗性逐渐退化(LeboIdus等，2012)，因此，急需培育聚合多个抗性基因的品种。
[0004]由于根肿病传染性强、具低浓度致病阈值(Hatakeyama等，2013)、传播速度快、传播途径多，以及我们对该病菌的生活史和致病成灾机制的认识不足等，使得根肿病成为世界范围内的毁灭性土传植物病害。利用传统的化学方法来防治根肿病并不能从根本上解决油菜根肿病传播，同时也带来了环境的污染，不利于农业的可持续发展。目前许多专家形成共识，解决油菜根肿病的有效方法是培育抗根肿病的油菜新品种，逐步淘汰没有抗性的品种。但是目前甘蓝型油菜中抗根肿病的油菜资源十分缺少，很难有效的应用到油菜育种中，而甘蓝型油菜的近缘物种白菜、甘蓝等中存在着许多抗根肿病的材料。因此，我们急需研究根肿病的遗传及作用机理，创制抗根肿病的油菜材料，培育抗根肿病的油菜新品种，并加以推广，缓解我国油菜根肿病的危害。
[0005]目前，大多数地方的根肿病的接种方法较为粗放，甚至很多单位仅以田间接种鉴定的结果作为判断植物是否抗根肿病，即使一些在实验室接种的也大多采用菌液拌土接种的方法，经常发生个体没有接种成功的现象，这样就给种质资源的抗根肿病鉴定带来很大的误差，常常上年度鉴定为抗根肿病的材料而下一年度表现为感根肿病。近年来根肿病在我国油菜主产区迅速蔓延，严重影响了我国油菜的生产，因此急需培育具有抗根肿病的油菜新品种。但由于我国甘蓝型油菜中抗根肿病的资源极为稀少，而其近缘物种白菜、甘蓝、黑芥中存在抗根肿病的材料，因此本发明拟采用远缘杂交的方法，利用白菜与甘蓝中的抗根肿病的种质资源，人工合成抗根肿病的甘蓝型油菜材料，摸索一条合成抗根肿病甘蓝型油菜品系的方法，弥补我国甘蓝型油菜抗根肿病资源的短缺。同时开展根肿病接种技术的研究，提高根肿病的接种效率，为根肿病的抗性鉴定提供良好的技术保证。因此，急需对原有的根肿病接种方法进行改良，提高根肿病接种成功效率。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0008]—种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，以抗根肿病的甘蓝为母本与抗根肿病的小白菜杂交，Fl代授粉15天后，挑选种子进行胚挽救，利用含2%的蔗糖的B5液体培养基培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2%鹿糖的B5固体培养基上，3-4叶期时利用0.1 %的秋水仙素处理2小时进行加倍，漂洗干净后移至土壤中，利用剥蕾授粉或者花期喷施盐水的方法使合成的植株自交，自交的种子在发芽期，利用根肿病P4生理小种接种，同时以感病的材料作为对照，同时接种;35天后，取出幼苗的根，洗净观察是否有肿块，没有肿块说明合成的植株具有根肿病抗性。
[0009]作为本发明进一步的方案:所述甘蓝为结球甘蓝品种世纪之绿的后代，所述小白菜为小白菜品种四季青菜的后代。
[00?0]作为本发明再进一步的方案:在抽薹期选取嫩叶利用Ploidy Analyzer对植株进行倍性鉴定，花期时观察植株的育性，最终判断加倍是否成功。
[0011 ]作为本发明再进一步的方案:所述剥蕾自交或者花期喷施盐水去除自交不亲和。
[0012]作为本发明再进一步的方案:具体的接种方法如下:将成熟的种子在滤纸上催芽后，将根部在107孢子/毫升的P4生理小种的菌液里浸泡2小时，然后移栽至含有弱酸性的略湿的基质中，同时每幼芽接种5毫升的107孢子/毫升菌液到基质中，将移栽幼芽移至温室中。
[0013]作为本发明再进一步的方案:所述的温室白天温度为22°C，夜晚温度为18°C。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:提供了一条选育抗根肿病甘蓝型油菜的品系有效途径，提高了根肿病接种效率。
【附图说明】
[0015]图1为人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法中的抗根肿病甘蓝型油菜品系的合成线路图。
[0016]图2为人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法中根肿病抗病性鉴定示意图。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]请参阅图1?2，本发明实施例中，一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，以抗根肿病的甘蓝(来自于结球甘蓝品种世纪之绿”的后代)为母本与抗根肿病的小白菜(来自于小白菜品种“四季青菜”的后代)杂交，F1代授粉15天后，挑选种子进行胚挽救，利用含2%的蔗糖的B5液体培养基培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2%蔗糖的B5固体培养基上，3-4叶期时利用0.1%的秋水仙素处理2小时进行加倍，漂洗干净后移至土壤中，在抽薹期选取嫩叶利用Ploidy Analyzer对植株进行倍性鉴定，花期时观察植株的育性，最终判断加倍是否成功。利用剥蕾授粉或者花期喷施盐水的方法使合成的植株自交(去除自交不亲和)，自交的种子在发芽期，利用根肿病P4生理小种接种，同时以感病的材料作为对照，同时接种，35天后，取出幼苗的根，洗净观察是否有肿块，没有肿块说明合成的植株具有根肿病抗性。
[0019]具体的接种方法如下:将成熟的种子在滤纸上催芽后，将根部在17孢子/毫升的P4生理小种的菌液里浸泡2小时，然后移栽至含有弱酸性的基质(略湿)中，同时每幼芽接种5毫升的17孢子/毫升菌液到基质中，将移栽幼芽移至温室中(22/18°C，白天/夜晚)，前3天尽量不要浇水，如果3天后出现缺水，就用喷壶适量喷施少量水分，仅保持基质的湿润，不要出现明水。
[0020]本发明利用白菜与甘蓝中的抗根肿病资源，人工合成抗根肿病的甘蓝型油菜，采用室内接种鉴定的方法，调整原有的室内接种参数，在种子发芽期接种幼苗根部，同时采用严格的管理措施，提尚接种成功效率。
[0021]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0022]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.一种人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，以抗根肿病的甘蓝为母本与抗根肿病的小白菜杂交，F1代授粉15天后，挑选种子进行胚挽救，利用含2%的蔗糖的B5液体培养基培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2%鹿糖的B5固体培养基上，3-4叶期时利用0.1 %的秋水仙素处理2小时进行加倍，漂洗干净后移至土壤中，利用剥蕾授粉或者花期喷施盐水的方法使合成的植株自交，自交的种子在发芽期，利用根肿病P4生理小种接种，同时以感病的材料作为对照，同时接种;35天后，取出幼苗的根，洗净观察是否有肿块，没有肿块说明合成的植株具有根肿病抗性。2.根据权利要求1所述的人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，所述甘蓝为结球甘蓝品种世纪之绿的后代，所述小白菜为小白菜品种四季青菜的后代。3.根据权利要求1所述的人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，在抽薹期选取嫩叶利用Ploidy Analyzer对植株进行倍性鉴定，花期时观察植株的育性，最终判断加倍是否成功。4.根据权利要求1所述的人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，所述剥蕾自交或者花期喷施盐水去除自交不亲和。5.根据权利要求1所述的人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，所述接种的具体的方法如下:将成熟的种子在滤纸上催芽后，将根部在107孢子/毫升的P4生理小种的菌液里浸泡2小时，然后移栽至含有弱酸性的略湿的基质中，同时每幼芽接种5毫升的17孢子/毫升菌液到基质中，将移栽幼芽移至温室中。6.根据权利要求5所述的人工合成抗根肿病甘蓝型油菜新材料的方法，其特征在于，所述的温室白天温度为22°C，夜晚温度为18°C。
【文档编号】A01H1/08GK106035059SQ201610363713
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】黄镇, 徐爱遐, 刘亚萍, 郎丽娜, 赵娜
【申请人】西北农林科技大学