一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8. 1位点紧密连锁的分子标记 A08-300的侧翼基因组序列、根据该侧翼序列设计的引物以该引物在筛选油菜抗根肿病植 株中的应用。
【背景技术】
[0002] 根肿病（Clubrootdisease)是由鞭毛菌亚门根肿菌属芸苔根肿菌 (Plasmodiophorabrassicae)侵染引起的一种传染性非常强的土壤病害。根肿病菌专 性寄生于芸薹属、萝卜属以及拟南芥等十字花科植物的根部。当根系受到病菌刺激，其薄 壁细胞大量分裂和增大而形成肿瘤。由于根的生理机能受阻抑，病株地上部则表现出叶 片失绿、无光泽、叶边变黄、生长缓慢、植株矮小以及萎蔫等症状。发病严重时可导致作物 绝收。目前根肿病对全世界油菜产量造成10-15%的损失，通过遗传转育的方式提高油菜 抗病性是被认为最有效的防治根肿病的措施（DixonG2009JofPlantGrowthRegul 28:194 - 202)。其中芜菁（AA，2n= 20)中含有的抗病位点最多，在抗病育种中应用也最 为广泛（DiederichsenE2009JournalofPlantGrowthRegulation, 28)。日韩等国以 芜菁为抗源培育出了多个抗根肿病的大白菜品种，而在欧洲也利用芜菁（ECD04)与抗病性 甘蓝（CC，2n= 18)杂交人工合成了甘蓝型油菜，进而培育出了抗病品种Mendel(RahmanH 2014CanadianJournalofPlantPathology, 36(suppl.1):122-134)〇
[0003] 2011年，我们获得了 1份抗根肿病的纯系芜菁材料E⑶04,芜菁E⑶04(AA)含有 多个抗病位点。朴钟云课题组利用ECD04和白菜构建的BC1F2群体定位到了 5个抗病位 点分别对2号、4号、7号和10号生理小种具有一定抗性。其中PbBa8. 1是唯一对4号生 理小种具有抗性的位点（JingJ，2013Plos0ne，8(12):e85307-e85307)。经过我们的研究 证明该位点同时对安徽黄山、湖北巴东地区的生理小种具有良好的抗性，其中与PbBa8. 1 位点遗传距离最近的2个侧翼标记为cnu_m090a、sau_um353a见（JingJ, 2013Plos One, 8(12) :e85307-e85307)。但这两个标记与大白菜抗根肿病基因PbBa8. 1的遗传距离较 远。本发明以ECD04抗源材料为供体，结合回交育种及分子标记辅助选择，将ECD04中抗4 号生理小种的抗病位点PbBa8. 1定向地向优良甘蓝型油菜常规品种华双5号转移。在此基 础上，通过对两亲本进行全基因组重测序，对cun_m090a和sau_um353a两对标记之间的序 列进行比较分析后，开发了与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8. 1紧密连锁的标记A08-300， 并精细定位该基因，从而简化甘蓝型油菜抗根肿病品种的转育过程。
[0004] 在常规油菜抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法 来鉴定中间材料的基因型，并且温度、湿度以及病原菌的田间分布等因素会影响到接种发 病率，进而影响抗病材料的正确选择及转育进程。本发明提供的分子标记及其选育方法可 以在育种过程中的任何时期根据基因型对单株进行有效选择，提高了选择效率、缩短育种 年限。本发明将为甘蓝型油菜抗根肿病育种提供重要支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了与芜菁E⑶04抗根肿病基因位点PbBa8. 1紧密连锁的分 子标记A08-300的侧翼序列，其序列为SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了根据芜菁E⑶04分子标记A08-300的侧翼序列设 计的特异性引物，该引物可特异鉴别SEQIDNO. 1所示序列。
[0007] 本发明的最后一个目的在于A08-300分子标记的侧翼序列及其引物在油菜抗根 肿病育种中的应用。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0009] 申请人通过以宪菁ECD04(JingjingChen等IdentificationofnovelQTLsfor isolate-specificpartialresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinBrassica rapa. [J] ?PlosOne, 2013, 8 (12) :e85307-e85307)为父本，易感常规甘蓝型油菜华双5号 为母本杂交，构建分离群体，发现了一个与芜菁抗根肿病PbBa8. 1基因位点紧密连锁的分 子标记A08-300 :
[0010] (1)ECD04中A08-300的侧翼序列如下：
[0011] 5?-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATATGCTTGAATAATTGAGTGAGGAT AAATATCAAGTGAAATTTGCCGAACCATGAAAGTAAAGCATTTAAATCTTATCCAGATTAAAAAAAAATCAAGTAAA TGTTTTTGGCCAACCACCGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGGTGTTGAAATTTTCCAAC GATGCCATGTAGACAAACACATTTTTACAACATCCTCACTGCAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATTTCAACACT CCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAAGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAATACATATA TGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTCAAAATTACGAAAACTTTAACCCAACATATCTTA AATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3 '
[0012] (2)华双5号中A08-300的侧翼序列序列如下：
[0013] 5?-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATGTGTTTGAATAATTGAGTGAGGAT AAATATCAAGTGAAATCTGCCGAACCAATGAAAATAAAGCATTTAAGTCTTATCCAGATTTAAAAAAAATCAAGTAA ATGTTTTTGGCCAACCACAGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGCTGTTGAAATTTTTCAA CGCCTGTTGCTACCATGTAGACAAACATATTTTTACAACATCCTCACTACAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATT TCAACACTCCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAGGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAA TACATATATGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTTGAAATTACGAAAAATTTAACCCAAC ATACCCTAAATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3'
[0014] 根据芜菁ECD04分子标记A08-300的侧翼序列设计的特异性引物，所述的引物优 选：FA08-300:5'-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3'；RA08-300:5'-CACAATGGAGTGTTGAAATTCA CT-3,
[0015] A08-300分子标记引物在油菜抗根肿病育种中的应用，包括利用上述引物对待测 植株DNA进行PCR扩增，能特异性的扩增出ECD04中，优选的，利用引物FA08-300:5 '-GTA GTGCGGGCCACAAAAT-3'；RA08-300:5' -CACAATGGAGTGITGAAAITCACT-3' 对待测植株DNA进 行PCR〇
[0016] 扩增结果中带有132bp条带的单株是含有抗根肿病位点PbBa8. 1的材料。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0018] 本发明公开的分子标记A08-300与芸薹属抗根肿病位点PbBa8. 1紧密连锁，可广 泛应用于芸薹属抗根肿病位点PbBa8. 1的分子标记辅助选择育种。本发明通过引物PCR扩 增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育种进程。
【附图说明】
[0019] 图1为E⑶04相对华双5号不同的碱基数差异所对应的Indel位点数量。
[0020] 图2为A08-300引物在亲本及BC3F2部分抗病、感病个体上的扩增结果示意图。
[0021] 其中▼为华5号、▲为E⑶04,图2中A是BC3F2部分抗病个体扩增结果示意图；图 2中B是BC3F2部分感病个体扩增结果示意图。
[0022] 图3为ZHE-226自交后代在湖北恩施巴东田间病圃的抗病性表现。
[0023] 箭头标识的是对照组，未标识的是抗病新株系。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :
[0025] 与甘蓝型油菜抗根肿病基因PbBa8. 1紧密连锁标记的获得与鉴定
[0026] 1、分离群体的构建
[0027] 以含有抗4号生理小种PbBa8. 1位点的芜菁ECD04(JingjingChen 等IdentificationofnovelQTLsforiso1ate-specificpartial resistancetoPlasmodiophorabrassicaeinBrassicarapa. [J].Plos One, 2013, 8 (12) :e85307-e85307)为父本，易感常规甘蓝型油菜华双5号为母本杂交获得 F1。以安徽黄山生理小种对F1进行抗病性鉴定，F1全部表现为抗病。接下来，我们将F1继 续和华双5号回交3代，分别获得BC1、BC2、BC3代回交群体，同时利用与PbBa8. 1位点两侧 与之连锁的SSR标记cum_m090a和sau_um353a开始对BC1群体进行基因型分析，从中筛选 出可能含有PbBa8. 1位点的单株用于后续的回交工作，直至获得BC2、BC3以及BC3F2群体。
[0028] 2014年秋天，我们将2个BC3F2群体在安徽黄山田间病圃进行了抗病性鉴定，结果 调查发现，对照组华双5号100%发病，其中一个包含117个单株编号为ZHE-226BC3F2测 试群体中发现抗病株系91株、感病株系27株，卡方测验结果表明该群体的抗感分离比符合 3:
[0029] 1分离（x2=〇.34〈x 2〇.〇5(1) =3.84)(图2)，以上结果说明该抗性由显性单基 因控制。
[0030] 2、与PbBaS. 1紧密连锁分子标记的开发
[0031] 为了快速开发出与抗病位点PbBaS. 1更加紧密连锁的分子标记，我们通过对两亲 本进行全基因组重测序。对E⑶04和华双5号分别进行40X、30X