一种油菜内生性深绿木霉ReTv2菌株及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种油菜内生性深绿木霉ReTv2菌株及其制备方法和应用， 申请人:从油菜根部组织分离到一种深绿木霉ReTv2菌株，CCTCC NO：M2014407。将ReTv2菌株在PDA培养基于28℃活化培养2-4d，得到分生孢子，将孢子接种于PDB培养基扩大培养6d，分生孢子含量可达1.0×109/mL。本发明的深绿木霉ReTv2菌株为油菜内生性菌株，可在油菜根部成功定殖并对油菜有促生作用，发酵液对油菜根肿病病菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用，该菌剂对油菜根肿病的防效达到了66.4%，并且可直接在播种时施用，施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安全的特性。CCTCC NO：M20144072014.09.10
【专利说明】一种油菜内生性深绿木霉ReTv2菌株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治【技术领域】，具体涉及一种用于油菜根肿病生物防治 的菌株深绿木霉ReTv2菌株，同时还涉及一种生防菌深绿木霉ReTv2菌剂的制备方法，还涉 及一种深绿木霉ReTv2菌株在制备治疗或预防油菜等十字花科植物根肿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 油菜是我国重要的油料作物之一，在油菜生产过程中面临多种病原菌的威胁。油 菜根肿病是由原生动物界根肿菌门芸薹根肿菌（Plasmodiophorabrassicae)引起的一种 重要病害，该病害主要危害寄主根部造成根部薄壁细胞增生而形成肿瘤，该病害同时也危 害其他多种十字花科植物。目前对于根肿病缺乏有效的防治手段，常规的抗病品种、种子处 理与化学药剂相结合的综合防治措施对该病防治效果欠佳。根肿病难以防治的主要原因在 于该病为典型的土传病害，根肿病菌的休眠孢子可以在缺乏寄主的条件下在土壤中存活很 多年，在病害一旦发生的情况下菌源积累极快，难以利用常规的化学防治方法进行有效防 治；同时目前也缺乏针对该病的有效抗病品种。针对根肿病目前难以有效防治的困难，在 根肿菌寄主群体中寻找可以利用的抗病种质资源及在寄主微生态环境或寄主中寻找有效 的生防菌进行生物防治均是解决目前根肿病防治困境的方向。目前也有不少学者在进行这 方面的尝试，如季海雯等分别在枝江、黄山根肿病重发病区对214个油菜品种进行抗性研 究，结果表明赣两优三号等12个油菜品种在枝江对4号生理小种表现抗病；成油杂6号等 3个杂交种在黄山对13号生理小种表现出抗病，可作为当地根肿病病区主栽品种及育种材 料使用（季海雯，硕士学位论文，2013)。徐海燕等也从9个云南主栽品种和国内新育成的 7个油菜品种中，筛选出A35、花油7号和云油双1号3个品种全生育期均表现出较强的抗 根肿病能力的品种（徐海燕，硕士学位论文，2011)。杨力帆等发现深绿木霉（Trichoderma atr〇viride)REMI突变菌株H6的发酵液对对根肿休眠孢子萌发有明显的抑制作用，对根肿 病具有一定的生物防治潜力（杨力帆，硕士学位论文，2010)。王会军等从油菜品种KT1004 和Y05-84-5-1的根部分离出51株内生菌，发现其中短小芽孢杆菌YN201305和枯草芽孢杆 菌YN201310菌株对十字花科根肿病菌有明显裂解和抑制作用（王会军等，中国油料作物学 报，2014,36(1) :92-97)。本发明则报道了一株能在油菜植株内生性生长，对油菜根肿病具 有显著防治效果的深绿木霉菌株及其在防治油菜根肿病中的应用。迄今为止未见有涉及本 发明主题的相关文献。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种生防菌深绿木霉ReTv2菌 株，CCTCCNO:M2014407,该菌株是自发病油菜田中的健康油菜植株分离筛选而来，该菌株 能在油菜根部定殖，对油菜有显著的促生作用，同时对油菜根肿病具有显著的防治效果。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供了一种深绿木霉ReTv2的制备方法，该方法取材容 易，制备过程简单，产量高，分生孢子产量可以达到IX109/mL。
[0005] 本发明还有一个目的在于提供了一种深绿木霉ReTv2在促进油菜生长中的应用。
[0006] 本发明还有一个目的在于提供了一种深绿木霉ReTv2发酵上清液在抑制油菜根 肿病菌休眠孢子萌发中的应用。
[0007] 本发明最后一个目的在于提供了一种深绿木霉ReTv2在制备治疗或预防十字花 科植物根肿病药物中的应用，所述的十字花科植物优选油菜。
[0008] 还包括深绿木霉ReTv2在同时促进油菜生长、制备预防或治疗油菜根肿病药物中 的应用。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现：
[0010] 本发明从湖北省枝江地区发病油菜田块的健康油菜根部组织分离筛选获得一株 适用于油菜根肿病防治的生防真菌深绿木霉（Trichodermaatroviride)菌株ReTv2,该菌 株能在油菜根内定殖，其在PDA培养基上的菌落形态如图1所示，该菌在PDA培养基上菌落 圆形，早期白色，后期因为产生大量的分生孢子呈绿色；分生孢子梗单轴近直角分支，分生 孢子近圆形；25°C为最适生长温度，在15°C或35°C条件下生长均极缓慢。
[0011] 该菌株于2014年9月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保 藏中心保藏，分类命名：深绿木霉（Trichodermaatroviride)ReTv2,保藏编号：CCTCCNO:M2014407,地址：中国武汉武汉大学。
[0012] 一种深绿木霉ReTv2的制备方法，其步骤如下：
[0013] 将ReTv2菌株在PDA培养基于28 °C活化培养2-4d，再接种到PDA斜面，在28 °C培养 4-6d，加入灭菌的去离子水，调整孢子液浓度为5XIO5孢子/mL，加入ImL的孢子液于250mL 的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，收集孢子制备成孢子悬浮液制剂。
[0014] 将深绿木霉ReTv2孢子悬浮液直接施用于培养基质，可促进油菜生长，同时可治 疗或预防油菜根肿病。
[0015] 将深绿木霉ReTv2发酵上清液施用于油菜基质，可抑制油菜根肿病菌休眠孢子萌 发。
[0016] 申请人:应用上述微生物菌剂对盆栽条件下的油菜根肿病进行了生物防治试验，均 达到了预期的效果。
[0017] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》的内容。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0019] 该菌为油菜内生性真菌，在处理时能进入油菜根部生长，可长期在植物内发挥防 治病害的功效；
[0020] 该菌不仅能防治病害，还对油菜有显著的促生作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为深绿木霉ReTv2的囷落不意图。
[0022] A为深绿木霉ReTv2孢子梗和孢子；
[0023]B为深绿木霉ReTv2形态图。
[0024] 图2为红色荧光蛋白RFP标记的生防菌菌株ReTv2在荧光显微镜示意图。
[0025]A为红色荧光蛋白RFP标记的生防菌菌株ReTv2发出红色荧光；
[0026] B为红色荧光显示该菌能在油菜根部成功定殖。
[0027] 图3.是本发明分离筛选的生防菌深绿木霉ReTv2对油菜生长的促进作用示意图。
[0028]A为ReTv2菌剂处理后油菜第一片真叶的直径明显增大；
[0029]B为ReTv2处理后油菜的根和茎的长度均大大增长。
[0030] 图4.为深绿木霉ReTv2对油菜根肿病的防治作用示意图。
[0031]A为ReTv2菌剂处理14d后油菜根毛中休眠孢子的侵染情况；
[0032]B为ReTv2菌剂处理42d后油菜根肿病的根部症状。 具体实施方案
[0033] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别 说明，均为商业流通或已报道的试剂。
[0034] 实施例1 :
[0035] 菌株的分离及鉴定
[0036] 1.菌株的分离地点及分离方法
[0037] 收集湖北省枝江地区发病油菜田块的健康油菜根部组织，清洗干净后用70%乙醇 浸泡lmin，用5%的NaOCl浸泡5min，之后用无菌水清洗3次。将根部切成0. 5cm的小段至 于PDA培养基上，在25 °C培养14天，将长出的真菌孢子在PDA平板上进行稀释培养，并进行 单孢纯化；获得一株真菌菌株将其编号为ReTv2,其菌落、孢子梗及孢子形态见图1，进一步 结合ITSDNA序列进行鉴定。
[0038] 2.菌株的16SrDNA鉴定
[0039] 取上述菌株ReTv2接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，28°C培养Id后刮取菌丝。
[0040] 采用CTAB法提取菌株的DNA，参考Sambrook等（1989)。具体步骤如下：称取0. 2g 菌丝在液氮中研磨成粉末，转入ImL65°C预热的抽提缓冲液（0.OlMTris-HCl，pH8. 0 ;2% CTAB，W/V;1· 4MNaCl, 121°C灭菌 30min)，65°C温育 5 ?8min，每 2min颠倒混勻；加入等体 积的苯酚/氯仿（1/1)，振荡器上充分混勻，12,OOOrpm离心IOmin,取上清，加入等体积的氯 仿再抽提一次；12,OOOrpm离心15min，取上清，加入0. 1倍体积的3M醋酸钠溶液和0. 6倍 体积的异丙醇轻轻混勻，-2(TC静置沉淀30min，12,OOOrpm离心15min，弃上清，将沉淀用70 % (体积比）乙醇洗两遍，置37°C温箱干燥后，加入适量20μITE溶解，-20°C保存。以真 菌ITS通用引物ITSl(5,TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和ITS4(5'TCCTCCGCTTAT TGATATGC3，）（Whiteetal.，1999)为引物，上述DNA为模板，对菌株ReTv2 的ITSrDNA 进行PCR扩增。
[0041]PCR采用 25μ1 的反应体系：CldH2O19. 8ul，IOmM的 10Xbuffer(含MgCl2) 2. 5ul， 2. 5mMdNTP0· 5μ1，10μM的引物ITSl0· 5μ1，10μM的引物ITS4 0· 5μ1，Taq酶 IU(5U/ul)，DNA模板（50ng/μI) 1μ1。
[0042]反应程序：（1)94°C3min;(2)94°C40s，54°C30s，72°Clmin，循环 35 次； (3)72°Clmin延伸。（4)4°C下保存。
[0043] 应用回收试剂盒将PCR产物回收并连接到pMD18-T(购自TaKaRa公司，中国大连） 上进行序列测定。测序后的序列见序列表SEQIDNO:1。将测序结果与GenBankQittp:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的ITSrDNA序列进行同源性比较，发现与深绿木霉 (Trichodermaatroviride)同源性达到100%，结合菌株菌落及孢子梗和孢子形态，将菌株 ReTv2鉴定为深绿木霉。
[0044]菌株ReTv2 的 16SrDNA序列为SEQIDNO:1 所示。
[0045] 将已经鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride)菌株ReTv2于2014年 9月10日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：深绿木霉（Trichoderma atroviride)ReTv2,保藏编号：CCTCCN0:M2014407,地址：中国武汉武汉大学。
[0046] 实施例2:
[0047] 深绿木霉ReTv2的制备方法，具体如下：
[0048] 将ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养2-4d，再接种到PDA斜面，在28°C培 养4-6d，加入灭菌的去离子水，调整孢子液浓度为5XIO5孢子/mL，加入ImL的孢子液于 250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，浓度可达IXlO9孢子/mL，收集 孢子制备成孢子悬浮液制剂。
[0049]PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至IOOOmL,调pH至 7. 0,在121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0050]PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至lOOOmL，调pH至7. 0,在121°C 高压蒸汽灭菌30min。
[0051] 实施例3:
[0052] 菌株ReTv2在油菜根部内生性验证
[0053] 以pCAMBIA1301为骨架构建RFP表达载体，在PDA上培养深绿木霉ReTv2菌株5-7 天后收集分生孢子，利用农杆菌介导的转化方法（LiMoxiao等，FEMSMicrobiolLett, 2005，243 (2) : 323-329)将RFP载体转化深绿木霉ReTv2菌株，在含有50ug/mL潮霉素的PDA 上筛选转化子，并在含有lOOug/mL潮霉素的PDA上进行第二轮筛选，最后挑选出能发红色 荧光且生物学表现无改变的菌株（图2中A)。
[0054]在200mL的PDB培养基中接种能发红色荧光转化菌株的IXIO6的孢子，在28°C、 200rpm的条件下培养15h，4000rpm离心5min收集孢子，无菌水清洗3次。将幼嫩的油菜根 部浸泡到含IXIO5AiL深绿木霉ReTv2孢子的MM培养基中，在22°C条件下共培养24h后在 荧光显微镜下观察深绿木霉ReTv2在油菜根部的定殖情况，结果发现该菌能成功在油菜根 部定殖（图2中B)。
[0055]MM培养基：硝酸铵I. 0g，磷酸二氢钾0. 5g，磷酸氢二钾I. 5g，氯化钠I. 0g，七水硫 酸镁0. 2g，补充蒸馈水至IOOOmL,调pH至7. 2,在121 °C高压蒸汽灭菌30min。
[0056] 实施例4:
[0057]ReTv2对油菜生长的促进作用
[0058] 在灭菌的培养基质（镇江培蕾基质科技发展有限公司）中加入ReTv2的分生孢 子，使孢子浓度为IXIO7孢子/g，接种孢子后立即加入油菜种子后置于20_23°C的光照培 养室中培养，以不接ReTv2菌株孢子的处理为对照。每个处理含60株油菜，重复3次。培养 25d后测量各处理中第一片真叶的直径，培养42d后测量各处理中油菜植株根茎的长度。结 果发现经过ReTv2处理后，植株第一片真叶的直径及油菜根茎的长度均有大幅提高，培养 25d时对照组第一片真叶的直径为6. 5cm，而ReTv2处理组第一片真叶的直径可达10.Ocm; 培养42d时对照组根茎的长度分别为8.Ocm和15. 5cm，而ReTv2处理组根茎的长度分别达 12. 5cm和19. 0cm，结果说明该菌株对油菜生长有明显的促进作用（图3)。
[0059] 实施例5:
[0060]ReTv2发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子萌发的抑制作用
[0061] 根肿菌休眠孢子的制备：将5g干的油菜根肿病发病组织置于150mL无菌水中浸泡 2h，将组织捣碎搅拌后用纱布过滤收集休眠孢子，用梯度离心的方法进一步纯化休眠孢子， 调整浓度为IXIO7孢子/mL。
[0062]油菜根分泌物的收集：将发芽3d后的油菜幼苗移栽到杯子中的滤纸上，让其根部 穿透滤纸浸入纸杯下部的营养液中，在20-23°C的光照培养室中培养14d后收集下部的液 体，用孔径为〇. 22μm的滤膜过滤后备用。
[0063] 菌株ReTv2发酵滤液的制备：将ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养2-4d，再 接种到PDA斜面，在28°C培养4-6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，加入ImL的孢子 液（5XIO5孢子/mL)于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，4000rpm， 15min收集上清备用。
[0064] 孢子萌发抑制试验：将5mL的根分泌物、0. 5mL纯化的休眠孢子及ImL的ReTv2发 酵滤液（PDB为对照）加入灭菌的离心管中，调整pH值为6. 3,在24°C的黑暗条件下培养， 在不同的时间点在光学显微镜下检测孢子的萌发率。结果显示在4d后，对照组休眠孢子萌 发率达到73 %，而ReTv2发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为26. 87 %，在6d后，对照组休 眠孢子萌发率达到100 %，而ReTv2发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为37. 57%，结果显 示ReTv2发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用。
[0065] 实施例6:
[0066] 菌株ReTv2对油菜根肿病的防治作用
[0067] 准备灭菌的培养基质，在播种前2d接种5mL的根肿菌休眠孢子（IXIO7休眠孢子 /mL)在培养基质中，接种混匀后基质中的休眠孢子浓度为2XIO6休眠孢子/g。
[0068] 在播种油菜后立即加入25mL的ReTv2分生孢子，加入后基质中ReTv2孢子浓度为 IXIO7孢子/g。加入25mL的无菌水为对照处理。
[0069] 将油菜置于20_23°C的光照培养室中，培养14d后收集不同处理的油菜根部，仔细 用清水清洗掉土壤后用无菌水润洗3次，切成Icm的小段后置于70%的乙醇中保存。用1 % 的醋酸胭脂红进行染色后在显微镜下观察根毛中的侵染情况，每个处理中至少计算40个 根毛的侵染情况进行统计分析不同处理中的根肿病发生率。
[0070] 菌株ReTv2对油菜根肿病的控制作用：按上述同样处理后的油菜置于20_23°C的 光照培养室中培养6周，每个处理均有60株油菜，且每处理重复3次。在第42d时进行病 害发生情况的统计。油菜根肿病分级标准为：〇级：没有根肿发生；1级：仅在侧根可见非常 小的肿瘤；2级：在主根和侧根均可见小的肿瘤；3级：在主根和侧根均可见中等到大的肿 瘤，植株长势衰弱；4级：出现非常严重的肿瘤，整个根部被完全破坏，植株长势严重衰弱。
[0071] 病情指数=Σ(病级数X该级病株数V(调查总数X最高病情指病级数）XlOO
[0072] 防效（％ )= 100%X(无菌水处理病情指数-处理病情指数）/无菌水处理病情 指数
[0073] 从试验结果可知，ReTv2菌剂处理可有效降低根肿菌休眠孢子在根毛中的侵染率 (表1，图4中A)，在14d时对照组根毛侵染率达89. 1 %，而ReTv2菌剂处理组仅为42. 3 %; 同时病情指数调查结果显示ReTv2菌剂处理对根肿病发生的非常明显的控制作用，在培养 42d后的调查结果显示，对照组的病情指数为62. 5,而ReTv2菌剂处理组的病情指数仅为 21. 0,防效达到66. 4% (表1，图4中B)。
[0074] 表1本发明的菌株ReTv2菌剂处理对油菜根肿病的防治效果
[0075]
【权利要求】
1. 一种深绿木霉ReTv2菌株，其特征在于：深绿木霉（fricAoofe/ma airoririofe) ReTv2, CCTCC NO ：M2014407〇
2. 权利要求1所述菌株的发酵上清液。
3. 权利要求2所述发酵上清液的制备方法，其步骤如下： 将权利要求1所述ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养2-4d，再接种到PDA斜面， 在28°C培养4-6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，调整孢子液浓度为5X 105孢子/ mL，加入lmL的孢子液于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，4000rpm， 15min收集上清。
4. 权利要求1所述菌株的制备方法，其步骤如下： 将权利要求1所述ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养2-4d，再接种到PDA斜 面，在28°C培养4-6d，加入灭菌的去离子水，调整孢子液浓度为5 X 105孢子/mL，加入lmL 的孢子液于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，分生孢子含量可达 1. OX 109/mL，收集孢子制备成孢子悬浮液制剂。
5. 权利要求1所述的菌株在促进油菜生长中的应用。
6. 权利要求1所述的菌株在制备治疗或预防植物根肿病药物中的应用。
7. 权利要求2所述的发酵上清液在抑制油菜根肿病菌休眠孢子萌发中的应用。
8. 权利要求1所述的菌株在同时促进油菜生长、制备预防或治疗油菜根肿病药物中的 应用。
【文档编号】C12N3/00GK104263656SQ201410459408
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】程家森, 穆罕默德·哈森, 姜道宏, 付艳苹, 谢甲涛 申请人:华中农业大学