改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构 建深绿木霉T23Δ化el菌株中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，全球对农副产品需求量（数量和质量）逐年提高，传统模式下的农作物种植 需要依靠高效的化学农药来预防病原微生物侵袭，W创造稳定、可观的经济效益，而多种化 学农药的田间使用所产生的负面效应日益彰显，首先一些病原菌对低剂量的化学农药产生 抗药性，杀灭活性受到影响；更重要的是，消费者对于食用健康、安全、无农药残留的农产品 及食品关注和重视程度不断提高。因此安全无毒的绿色生防制品的研发势在必行。木霉菌 剂成为最具潜力和前景的生防制品，它们具有括抗和抑制多种植物病源真菌、促进植物生 长、提高营养利用效率，诱导植物抗性，激发防御能力和修复农用化肥造成环境污染等系列 功能。木霉菌与病原菌互作过程中，括抗机制中关键因素之一是分解细胞壁水解酶。
[0003] 已有研究表明：木霉菌碳代谢抑制子CRE1全局性调控细胞生长代谢过程，保障木 霉在不同生境中的存活及括抗病原菌特性。木霉菌分子水平的遗传改造主要通过的是原生 质体融合或根癌农杆菌介导的遗传转化（ATMT)等。ATMT转化是目前比较常用、相对简单快 捷的方法，其主要利用同源重组的原理实现基因的敲除。在Ti质粒的T-DNA左右边界内构 建需要转化的遗传元件，如同源重组敲除框、报告基因表达框等，利用农杆菌与受体菌的分 子互作，将T-DNA中的遗传元件导入受体菌细胞核内，进一步整合到受体菌染色体组中，或 者通过同源片段的互补配对，实现目的基因的双交换敲除。在构建敲除株的过程中，敲除载 体和同源重组敲除框的构建十分关键，结构正确的敲除载体是获得基因敲除突变株的分子 基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种改良ATMT在构建深绿木霉T23Δ化el中的应用。通 过改进ATMT介导的遗传转化方法，将深绿木霉菌T23染色体的crel基因进行敲除，获得的 敲除株具有高产细胞壁降解酶的特性，提高了木霉菌括抗多种病原菌的生防效果。
[0005] 本发明首先克隆和分析了深绿木霉的碳代谢抑制因子CRE1的编码序列、蛋白结 构等，然后从构建敲除载体出发，通过对crel基因侧翼序列的PCR扩增，再将上下游侧翼 序列分别插入敲除质粒PC1300化潮霉素筛选标记的上下游，形成可W与基因组互补配对 的同源臂。然后将构建好的重组质粒导入根癌农杆菌中，利用改进的ATMT转化，得到阳性 转化子，再利用PCR和Southernblot等筛选和验证crel基因敲除突变株。碳代谢抑制因 子CRE1抑制了细胞壁降解酶中纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、几下质酶和葡聚糖酶等酶的表 达，间接了影响了生防木霉对植物病原真菌细胞壁等降解过程。因此，T23Acrel菌株具有 高产细胞壁降解酶的高效括抗菌株，未来可W用于木霉菌剂的研发。
[0006] 本发明涉及的深绿木霉T23Δ化el菌株为深绿木霉（Trichoderma.atroviride)， 已经于2015年11月3日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO:11574。
[0007] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：
[0008] 本发明设及一种改良的农杆菌介导ATMT转化方法在构建深绿木霉基因敲除菌株 中的应用，所述转化方法采用的诱导培养基为含200umol/LMES和200umol/LAS的IM培 养基，诱导时间为36h~4她。
[0009] 优选的，采用的选择性培养基为含200μg/mL潮霉素和300μg/mL特美汀的IM固 体培养基。其中，IM固体培养基：10mMK2HPO4,lOmMKH2PO4, 2.5mM化C1,2mMΜ拆〇4, 0. 7mM CaClz，9mMFeS〇4· 7&〇, 4mM(畑4)2SO4,lOmM葡萄糖，40mMMES(pH5.3)，200μΜAS,0. 5 % 甘油，1. 4%琼脂。传统的选择性培养基由CYA培养基或PDA加抗生素组成，不含诱导剂，因 此在筛选过程中不产生诱导作用，而转化诱导时间仅36h，对深绿木霉而言，诱导时间不足， ATMT转化效率低；将传统选择性培养基优化为IM培养基，并加入200μg/L潮霉素，诱导剂 与抗生素同时作用，实现边诱导边筛选，抗生素的存在避免了抱子形成，而诱导剂诱导时间 延长，提升了转化效率。300μg/mL特美汀添加更大程度抑制农杆菌的生长。此方法减少农 杆菌在侵染过程中阻力，增加其侵染效率，与传统的ATMT方法相比，能够显著提高转化效 率及转化子的稳定性。
[0010] 优选的，所述转化方法中进行诱导培养时，采用的深绿木霉抱悬液中分生抱子的 浓度为8X1〇6个/mL。
[0011] 优选的，所述深绿木霉基因敲除菌株为敲除深绿木霉T23基因组中的化el 基因而得的深绿木霉T23Δ化el菌株；所述深绿木霉T23Δ化el菌株为深绿木霉 灯.atroviride)CGMCCN0:11574。
[0012] 优选的，所述转化方法包括如下步骤：
[0013]A1、在前期诱导共培养时，在所述诱导培养基中放入玻璃纸，再在玻璃纸上均匀涂 布导入重组质粒PC1300化-Δcrel的根癌农杆菌的菌液和深绿木霉T23抱悬液的等体积混 合液，于25 °C培养箱共培养36~4她；
[0014]A2、待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产抱的临界时期将玻璃纸转移至所述选择性 培养基，于25Γ培养5~7山长出转化子；
[001引 A3、挑选可能的转化子到含300μg/mL的头抱与200μg/mL的潮霉素的PDA培养 基，验证后在300μg/血特美汀的PDA平板上传3代后，单抱分离再传一代后，用含潮霉素 的平板验证，再经PCR验证得到阳性的转化子。
[0016] 其中，重组质粒PC1300化-Acrel的构建是W提取的深绿木霉T23的基因组DNA 为模板，分别对crel基因侧翼序列进行PCR特异性扩增，获得crel基因的上、下游侧翼序 列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒PC1300化的上、下游而形成的。
[0017] 优选的，所述构建深绿木霉基因敲除菌株包括如下步骤：
[001引S1、获取深绿木霉T23的crel基因序列；
[0019] S2、重组质粒PC1300化-Acrel的构建：W提取的深绿木霉T23的基因组DNA为模 板，对crel基因序列进行PCR特异性扩增，获得crel基因的上、下游侧翼序列；将上、下游 侧翼序列分别导入敲除质粒pC1300化的上、下游，形成重组质粒pC1300化-Acrel;
[0020] S3、将所述重组质粒PC1300化-Δcrel转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆 提取重组质粒PC1300化-Δcrel，导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化，获得所述深绿木霉 T23ΔCrel菌株。
[0021] 优选的，步骤S1中，所述获取包括：根据crel蛋白检索号检索深绿木霉T23的 cDNA全序列，截取同源片段检索全基因组序列查得所述深绿木霉T23的crel基因序列。 [002引优选的，步骤S2中，扩增crel基因序列上游的引物为pcrel-F和pcrel-R;所述 pcrel-F的序列如沈QIDNO. 1所示，所述pcrel-R的序列如沈QIDNO. 2所示。
[0023] 优选的，获得的上游侧翼序列的长度为71化P。
[0024] 优选的，步骤S2中，扩增crel基因序列下游的引物为dcrel-F和dcrel-R;所述 dcrel-F的序列如沈QIDNO. 3所示，所述dcrel的序列如沈QIDNO. 4所示。
[00巧]优选的，步骤S2中，所述导入包括如下步骤：
[0026]B1、分别用限制性内切酶化ndIII和PstI酶切crel基因上游侧翼序 列crel-up和敲除质粒PC1300化，纯化酶切产物，用T4连接酶连接酶切产物，进行 大肠杆菌转化；取阳性克隆，W单菌落为模板进行菌落PCR，筛选阳性克隆提取质粒 pClSOOqh::crel-up::hyg；
[0027]B2、分别用限制性内切酶化ηI和EcoRI酶切下游侧翼序列ere1-down和 质粒pC1300cih: :crel-up: :hyg，经T4连接酶将crel基因下游侧翼序列导入质粒 pC1300cih: :crel-