一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐 热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C. 3. 1. 1. 73，ferulicacid esterase，FAE)又称肉桂酸醋酶，是 一种新型酶制剂，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木质素阿魏酸酯 为底物，破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易 被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值。阿魏酸具有多种 生理功能如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突 变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫等。因此，在食品工业中可利用该酶打断阿魏酸 与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，获得功能性食 品基料。阿魏酸酯酶在食品工业中具有广阔的应用前景。
[0003] 在饲料工业中，农作物植物性的纤维原材料经过阿魏酸酯酶处理后，阿魏酸从植 物细胞壁的结构中游离出来，植物材料致密的细胞骨架结构受到破坏，打破了木质素、半纤 维素及纤维素之间的连接，这种疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可显著提 高饲料的利用率。
[0004] 纤维素酶是一类能降解纤维素中e -1，4糖苷键的0-糖基化水解酶。在饲料业生 产中，纤维素酶作为一种新型的饲料添加剂，添加剂量一般在〇. 1% _〇. 3%。由于植物细胞 壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成的，阻止了动物对植物细胞内营养物质的消化吸收， 纤维素酶能在动物体内分解结构复杂的纤维素，摧毁植物细胞壁并释放营养物质，生成易 于消化的葡萄糖，使饲料的利用率增大，同时增进酸度，激活胃蛋白酶，促进消化吸收；纤维 素酶还能显著减少动物肠道内大肠杆菌的数量并促进有益微生物的生长，改善肠道内菌群 平衡。
[0005] 目前已经筛选到多种分泌阿魏酸酯酶和纤维素酶的微生物菌株，包括真菌、 细菌和酵母。发现的产阿魏酸醋酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillusniger)、链霉 菌（如 Streptomycesavermitilis)、梭菌（如 Clostridiumthermocellum)、杆菌（如 Bacillussp.)、乳酸杆菌（Lactobacilli)、假单胞菌（如 Pseudomonasfluorescens) 等。但绝大多数阿魏酸醋酶从真菌中分离得到，如米曲霉（Aspergi 1 lusoryzae)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、尖孢镰刀 菌（Fusariumoxysporum)、嗜热侧抱霉（Sporotrichumthermophile)、黄柄 曲霉（Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)、青霉类（Penicillium) 〇
[0006] 目前，阿魏酸酯酶在饲料工业中的需求很大，而应用于工业的阿魏酸酯酶主要来 源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，在工业生产使用过 程中，阿魏酸酯酶酶活损失严重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。本发明的 产阿魏酸醋酶的菌株为深绿木霉（Trichoderma atroviride)，为第一次报道，而且该菌株 除了产生阿魏酸酯酶以外，还高产高活性的纤维素酶。同时所产阿魏酸酯酶具有很强的耐 热性、耐酸性。这些特性非常适合其在饲料工业中应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的 准备、孢子悬液的制备、摇瓶液体发酵、复合酶制剂的制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶 与纤维素酶复合酶制剂，该复合酶制剂耐高温、酸碱稳定性好。
[0008] 所述的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No. 8673。
[0009] 所述三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，包括以 下步骤：
[0010] 步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉菌种Aws26在PDA活化培养基上划线活化， 置于37-4CTC恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种；
[0011] 步骤2,制备深绿木霉孢子悬液：从步骤1活化好的菌种中刮取深绿木霉菌丝，转 移至深绿木霉孢子培养基上，置于37-40°C生化培养箱内培养培养72h至菌丝长出孢子，经 两次传代培养恢复其活力，以含有〇. 01 %吐温80的无菌水洗涤收集孢子，制备孢子含量为 1. OX 108CFU/mL的孢子悬液；
[0012] 步骤3,复合酶摇瓶液体发酵：将步骤2所得孢子悬液，以4-8V/V %接种量接 入装有100_150mL摇瓶发酵培养基一的三角瓶中，40-42°C摇床发酵18-24h，摇床转速 160-200r/min ;然后将灭好菌的摇瓶发酵培养基二100-150mL倒入以上发酵18-24h后的 三角瓶中，发酵温度降至35-37°C，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时，温度降至 30-35h，继续发酵24-48h，发酵终止，得混合酶发酵液；
[0013] 步骤4,复合酶制剂的制备：取步骤3所得混合酶发酵液，过滤后将滤液8000r/ min、离心20min，取上清液，经超滤膜浓缩两次，浓缩液在50-60°C条件下真空浓缩，在所得 粗酶液中加入保护剂2-3wt%的糊精、l-3wt%的可溶性淀粉、0. 1-0. 2wt%的山梨酸钾，搅 拌分散后，_20°C冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35°C下，冷冻15-18h，即得复合酶制剂。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中所述PDA活化培养基的配方为：土豆浸出液 100mL，无机盐液 lmL，鹿糖 2g，琼脂粉 1. 5g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌 15min。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中所述深绿木霉孢子培养基的配方为：土豆 浸出液50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖lg，琼脂粉1. 5g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌15min ;其中， 土豆浸出液：土豆削皮切成lcm3小块，称取200g，加入1000mL水，煮沸30min，过滤，定容到 1000mL ;麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中所述摇瓶发酵培养基一的配方为：蛋白胨 〇? 5g、葡萄糖 0? 5g、硫酸铵 0? 5g、牛肉膏 0? 2-0. 5g、NaCl 0? 5g、KH2P04 0? lg、MgS04 ? 7H20 0? 04g、CaCl2 0? 2-0. 5g，去离子水 100mL，pH6. 5-6. 8,121°C 灭菌灭菌 20min ;摇瓶发酵培养 基二的配方为：麸皮粉2g、花生壳粉lg、米糠粉lg、豆饼粉1-1. 5g、玉米浆lg、尿素0. 5g、 NH4N03 0? 5g、吐温802g，微量元素 lmL，去离子水 100mL，pH6. 5-6. 8，121°C灭菌 20min;其中， 微量元素的配方为：MnCl2 ? 4H20 0? lg，CoCl2 0? 05g，CuS04 0? 02g，MgS04 0? 3g，K2HP04 lg， FeS04 ? 7H20 0? lg，ZnCl2 0? 03g，LiCl 0? 05g，CaCl2 0? 05g，H3B03 0? Olg，KI 0? 5g，去离子 水 lOOOmL。
[0017] 本发明得到复合酶制剂中阿魏酸酯酶酶活力达512U/g、纤维素酶酶活力达 2512U/g，复合酶制剂可溶于水、无异味，且热稳定性好，35°C保存6个月后酶活力仍大于 90%;复合酶制剂催化活性强，最适作用温度在45°C _70°C，最适作用pH值范围在4. 5-7. 0。 本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸杆分、麸 皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规 模化发酵罐培养生产。
【附图说明】
[0018] 图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶与纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0019] 图2为实施例3中pH值对阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0020] 图3为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶酶的热稳定性曲线；
[0021] 图4为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶pH稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0024] 步骤1，采样及样品处理：
[0025] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0026] 步骤2,富集培养：
[0027] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-