一种检测汞离子的比色传感器及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测汞离子的比色传感器。采用如下步骤制备而成：探针的杂交，信号放大和比色检测，本发明制备的传感器实现了对目标物汞离子的高特异性检测；利用核酸工具酶，起到了信号放大的作用。
【专利说明】
一种检测汞离子的比色传感器及其制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测汞离子的比色传感器。
【背景技术】
[0002]
汞是银白色闪亮的重质液体，化学性质稳定，不溶于酸也不溶于碱。汞常温下即可蒸发，汞蒸气和汞的化合物多有剧毒(慢性)。汞是自然生成的元素，见于空气、水和土壤中。汞是一种剧毒非必需元素，广泛存在于各类环境介质和食物链(尤其是鱼类)中，其踪迹遍布全球各个角落。汞可以在生物体内积累，很容易被皮肤以及呼吸道和消化道吸收。水俣病是萊中毒的一种。萊破坏中枢神经系统，对口、粘I旲和牙齿有不良影响。长时间暴露在尚萊环境中可以导致脑损伤和死亡。尽管汞沸点很高，但在室内温度下饱和的汞蒸气已经达到了中毒剂量的数倍。因而对食品、药品及饮用水中金属汞进行检测是十分必要的。
[0003]检测汞的传统方法主要有三种，分别是原子荧光光谱分析法、冷原子吸收光谱法和二硫腙比色法，这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
【发明内容】
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一种检测汞的比色传感器。
[0004]本发明是通过以下步骤得到的:
本发明中一共用到了 2条probe链，其序列分别是:
Probe 1:5’- TCTTGCTTYkGT kS，(SEQ ID NO:1);
Probe2: 5 ’ -AACCCAACCCGCCCTACCCCCTCAGCTTGGGTTATCG TACTATTGCTTGA-?, ’ (SEQ IDN0:2)；
其中Probe I的斜体部分是Hg的识别，下划线部分标注的是5个无汞的不稳定碱基。Probe 2中5 ’端为血红素适配体的互补列，中间下划线部分为切割位点，黑色斜体标注的部分与5’端互补成发卡，斜体下划线部分为汞的识别。
[0005]本发明中用到了两种酶:phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI内切酶。phi29 DNA聚合酶在引物与模板的作用下，沿着模板链从5’端向3’端生长，聚合出与模板链碱基完全互补的系列。他.BbvCI内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是:CCTCAGC，切割位点是最后两个喊基之间。
[0006]本发明中汞的检测是在均相溶液中实现的，通过循环的方式来实现信号的放大，从而实现汞的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
[0007]均相中发生的反应主要有:HAP (即Probe2)由三部分组成:血红素aptamer，内切酶Nb.BbvCI的识别序列和引物(primer)的互补序列。当有萊存在时，由于血红素aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，可以将发卡打开，使HAP上内切酶Nb.BbvCI的识别序列和引物(primer)的互补序列以单链的形式暴露在外面。随后均相中的primer可以通过碱基互补配对与打开的HAP杂交成一定的双链。在phi29DNA聚合酶的作用下，primer以打开的HAP为模板生长成完全互补的杂交双链，并释放出目标物汞离子，游离出来的汞离子可以继续打开别的发卡，然后重复上述过程。此为第一步循环放大(目标物诱导的循环放大)。
[0008]第二步放大仍是在均相中产生的，上述循环放大的结果是产生大量的血红素aptamer。在有大量血红素aptamer的情况下加入血红素，在血红素存在的条件下，血红素绑定住血红素aptamer，然后将均相反应后的产物滴加ABTS及双氧水。产生明显的颜色变化。其具体原理如图1。
[0009]在均相反应中，反应条件为37°C，反应时间是2h。
[0010]所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
(1)对DNA探针进行杂交；
(2)对检测的特异性序列进行信号的放大；
(3)对序列进行比色检测；
所述的制备方法，步骤(I)具体操作步骤如下:将2yLProbe I与2yLProbe 2的混合液，在37°C下孵育0.5h。
[0011]所述的制备方法，步骤(2)具体操作步骤为将(I)中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入dNTPs，phi 29DNA聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37 °C的恒温箱中孵育Ih;
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
[0012]该发明的检测方式是比色检测，利用紫外光谱仪进行检测。在检测之前，将步骤
(2)中产生的大量的血红素aptamer与血红素混合，然后在37°C孵育Ih使其产生信号。最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
[0013]本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的Phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。
[0014]本发明的有益效果:
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用血红素的aptamer作为识别物质实现了对目标物萊的尚特异性检测；
2、利用具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，实现了目标物的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；
3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合聚合酶，生成了大量可作为二级目标物的血红素aptamer，实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度；
4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
6、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于食品，水中汞的检测和生物传感器产业化的实际应用；7、制作的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
【附图说明】
[0015]
图1为本发明的原理图；
图2为汞离子特异性优化检测结果图；
图3为酶特异性检测结果图；
图4为灵敏度检测的工作曲线。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0017]实施例1
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
(1)对DNA探针进行杂交；；
(2)对检测的特异性序列进行信号的放大；
(3)对序列进行比色检测。
[0018]所述的制备方法，步骤(I)的具体的操作步骤如下:将2yLProbe I与2yLProbe 2的混合液，在37 °C下孵育0.5h。
[0019]所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下:
将(I )中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入d N T P s，P h i 2 9 D N A聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37 °C的恒温箱中孵育Ih;
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
[0020]在检测之前，将步骤(2)中产生的大量的血红素aptamer与血红素混合，然后在37°C孵育Ih使其产生信号。最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
[0021]本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。具体原理图如图1所示。
[0022]特异性优化实验:
链循环的主要步骤如下:
a、在加入目标物的离心管中加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI内切酶；
b、振荡均匀后，在37°C孵育lh。
[0023]下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤:
C、将灭菌水，10 X 的buffer缓冲液、probe2(2yL) , probel(2yL)，phi29 DNA聚合酶(2yL),dNTPs(2 yL),Nb.BBvcI 内切酶(2 410和待测目标物1^2+及03+，〇(12+，卩62+，〇&2+，012+，Pb2+，Ag+，Zn2Mg2+，加入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育Ih。
[0024]d、将水浴好的混合溶液加入phi29 DNA聚合酶与Nb.BBvcI内切酶及dNTPs; e、将(d)中的混合溶液继续放在37 0C的恒温箱中孵育Ih。
[0025]d、用ABTS及紫外光谱仪进行检测
加入汞离子的样品中吸光度的峰值最大，加入其他离子的样品中吸光度的峰值与空白相差无几。以此检测目标物具有特异性。
[0026]结果见图2。
[0027]酶特异性选择实验
a、在离心管中加入2yL的PHI29的buffeKbuffer为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液)；
b、将SyL的灭菌水和目标物加入离心管中，并振荡均匀；
c、在加入目标物的离心管中加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI内切酶和IyL血红素；
d、其它的管中，加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶:2yL的DNTP，2yLNb.BbvCI内切酶；2yL的DNTP，IyL的血红素；
全部在室温下孵育一小时，根据图3可以看出，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI内切酶和IyL血红素在实验中扮演了重要的作用，缺一不可。证明只有在核酸工具酶的作用下，汞离子才能产生血红素的适配体，从而能和血红素发生反应，得以对汞离子进行特异性的检测。
[0028]灵敏度实验
1)在8个离心管中加入241^的口1'<^61和口1'(^62，及241^:)!1129的131^€61'(131^€61'为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液)和8yL的灭菌水，I号到7号分别依次加入10—5M, 10—6M, 10—7M,10—8M，10—9M，10—1QM，10—11M浓度的汞离子溶液2yL，0号加入2yL的灭菌水，在37度水浴箱中反应I小时；
2)在O到7号的离心管中加入终浓度为2*10—8M的DNTP，20units的Phi29DNA聚合酶，20units Nb.BbvCI内切酶，在37度水浴箱中反应一小时:
3)在O到7号的离心管中加入终浓度为10—9H1l的血红素，37度反应一小时；
4)最后加入ABTS为6*10—7mol，双氧水3%浓度的双氧水3yL，即可通过紫外光谱仪进行检测。
[0029 ]结果如图4所示，通过图4可知，当汞离子的浓度到I O—11M/!时，峰值和空白相差不大，当汞离子的浓度到10—5 M/L时，峰值和10—6M/L相差不大，所以汞离子的检测范围是在10—5 M/L到 10—nM/L之间。
[0030]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种检测汞离子的比色传感器，其特征在于，其制备包括以下步骤: (1)对探针进行杂交； (2)信号的放大； (3)比色检测。2.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤(I)的具体工艺为:将2yLProbe I与2yLProbe 2的混合液，在37°C下孵育0.5h。3.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤(2)的具体工艺为:将步骤(I)制备孵育液加入dNTPs，phi29DNA聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37°(:的恒温箱中孵育lh。4.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤(3)为将(2)中的混合溶液与血红素一同混合，并继续放在37°C的恒温箱中孵育lh，采用紫外光谱仪进行比色检测。
【文档编号】G01N21/33GK106093023SQ201610406300
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】王玉, 崔雪君, 黄加栋, 刘素, 冉令芝, 郭玉娜, 邱婷婷
【申请人】济南大学