检测端粒酶的亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰纤维化纸传感器及其制备方法与流程

本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种基于亚甲基蓝、上转换纳米粒的修饰纤维化纸传感器的制备方法，主要用于对肿瘤标志物-端粒酶的检测，利用纤维化纸的毛细作用承载待测液进行生物反应，分别应用功能化介导的亚甲基蓝与上转换纳米粒子表征细胞内端粒酶活性，从而实现对癌症肿瘤疾病的早期诊断。

背景技术：

端粒是一种特殊的核酸复合物，以其内在rna为模板，通过逆转录的方式，催化人类染色体3’端重复序列(ttaggg)n的生成，防止染色体dna的重组、融合、损失。端粒酶可以调控端粒的长短，进而控制细胞生命活动。研究发现，端粒酶的活性在人类正常体细胞内受到抑制，而在绝大多数癌变细胞(85-90％)中被重新激活，从而赋予肿瘤细胞无限增殖的能力。由于细胞的癌变与发生、发展都与端粒酶活性有关，端粒酶已成为最常见的肿瘤标志物之一，此外，端粒酶和端粒结构在其他疾病、细胞的衰老、基因调控和哺乳动物的克隆中也起到关键作用。因此，准确而灵敏的端粒酶活性检测技术的建立对于基于端粒酶的癌症诊断与治疗来说至关重要。

过去的几十年里，许多端粒酶活性检测技术建立了起来，其中最常用的检测方式为基于聚合酶链反应(pcr)的端粒重复序列扩增协议法(trap)。[参见：j.p.jakupciak，w.wang，p.e.barker，s.srivastava，d.h.atha.journalofmoleculardiagnostics.2004，6，157-165.]但是，此法存在许多缺点，包括昂贵的仪器与试剂、耗时费力、聚合酶限制。[参见：g.krupp，k.kuhne，s.tamm，w.klapper，k.heidom，a.rott，r.parwaresch.nucleicacidsres.1997，25，919-921.]为了克服这些缺陷，众多非pcr协议法发展起来，如光学传感器法、表面等离子体共振法、荧光法、电化学发光法等。[参见：(a)p.m.schmidt，etal，biol.chem.2002，383，1659.(b)c.maesawa，etal.nucleicacidsres.2003，31.(c)c.ding，x.li，y.ge，s，zhang.anal.chem.2010，82，2850.(d)v.pavlov，etal.anal.chem.2004，76，2152.]近年来，改性金纳米粒子传感器和基于场效应的硅纳米线也被应用于端粒酶检测中。[参见：(a)y.xiao，k.y.dane，t.uzawa，a.csordas，j.qian，h.t.soh，p.s.daugherty，e.t.lagally，a.j.heeger，k.w.plaxco.j.am.chem.soc.2010，132，15299.(b)g.zhang，w.l.daniel，c.a.mirkin.j.am.chem.soc.2008，130，9644.(c)g.f.zheng，f.patolsky，y.cui，w.u.wang，c.m.lieber.nat.biotechnol.2005，23，1294.]尽管这些方法设计巧妙并且有些弥补了pcr技术的不足，但是这些新方法大多仍旧存在着检测步骤繁多、需要复杂仪器设备以及费时问题，更重要的是，这些研究大多集中于液相的反应体系，通常是不稳定的，并且在实验室外进行也是不切实际的。因此，上述检测方法不适用于针对严重疾病进行现场医疗即时(poc)诊断。[参见：k.pardee，a.a.green，d.e.cameron，a.d.keyser，p.yin，j.j.collins.cell.2014，159，940-954.]

近年来，扩增技术已被应用至肿瘤细胞内微核糖核酸原位成像的荧光增强中和药物的肿瘤特异性交付中。[参见：(a)r.deng，l.tang，q.tian，y.wang，l.lin，j.li.angew.chem.int.ed.2014，53，2389-2393.(b)j.ge，l.zhang，s.liu，r.yu，x.chu.anal.chem.2014，86，1808-1815.(c)j.h.kim，m.jang，y.kim，h.j.ahn.j.med.chem.2015，58，7863-7873.]纤维化纸与液相体系相比具有良好的稳定性、可视性与便捷性，适用于许多生物检测，如电化学检测、血糖监测等。[参见：(a)r.f.carvalhal，m.s.kfouri，m.h.o.piazetta，a.l.gobbi，l.t.kubota.anal.chem.2010，82，1162-1165.(b)y.song，p.gyarmati，a.c.araujo，j.lundeberg，h.brnmer，p.l.stahl.anal.chem.2014，86，1575-1582.]

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测端粒酶的亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰纤维化纸传感器，采用端粒延长滚换扩增技术，实现对端粒酶活性的检测。

采用的技术方案：

一种基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰的纤维化纸传感器，所述的纤维化纸规格为15*15mm，厚度为0.54mm，通过两片正中开有直径5mm圆孔，15*15mm大小，厚度为2mm的亚克力板材进行夹持固定成纸基板。

制备所述的纤维化纸传感器，按以下步骤进行：

(1)、纤维化纸的预处理：将纤维化纸裁剪成15*15mm大小，浸于100～200mlnaio4和licl混合溶液中，50～80℃水浴条件下加热30～90分钟，反应完成后，用蒸馏水洗涤纤维化纸，30～60℃下干燥，得干燥后的纤维化纸。

(2)、纤维化纸基板的制备：将步骤(1)所制得的纤维化纸用两片正中开有直径3～7mm圆孔，15*15mm大小，厚度为2mm的亚克力板材进行夹持固定成纸基板，将制成的纸基板于紫外线下灭菌30～90min。随后进行纤维化纸基板修饰。

所述的修饰纤维化纸传感器的制备方法为：

在纤维化纸基板中央凹槽滴加10～40μl含氨基修饰的适配体(ts-nh2)3-8μm)和nacnbh3(20～80mm)的hepes缓冲液溶液，20～40℃下培育30～90分钟，培育结束后，先后用pbs缓冲液和蒸馏水洗涤，冻干备用。适配体序列为：ts-nh2：5’-nh2(ch2)6ttttttaatccgtcgagcagagtt-3’；扩增适配体(te)：5’-sh(ch2)6tt(ttaggg)9-3’；捕捉适配体(tc-nh2)：5’-ccctaaccctaaaaaa(ch2)3nh2-3’。

所述的基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰的纤维化纸传感器检测肿瘤标志物-端粒酶活性的方法步骤包括：

取5～10μl1×trap缓冲液，3～8μldntps(10mm)溶液，2～3μl核苷酸酶抑制剂(rnaseinhibitor)，10～40μl扩增适配体te(3-8μm)和4～10μl细胞提取溶液于纸基板中央凹槽，在20～40℃条件下孵育60分钟扩增反应，反应结束后先用ph8.0的tris-hcl轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，然后滴加10～30μl备好的tc-ucnps或tc-亚甲基蓝溶液于纸基板凹槽中，在37℃条件下孵育20～60分钟，后用trap缓冲溶液轻轻地充分洗涤，37℃下干燥，然后分别进行上转换荧光强度分析和颜色色度分析。

与现有的标准分析方法pcr-trap法以及相继发展的非pcr技术的荧光法、电化学发光法等相比，本发明所提供的基于亚甲基蓝、上转换纳米粒的修饰纤维化纸传感器具有以下优点：

(1)、无需复杂的仪器设备，试剂用量少，检测成本低。而pcr-trap法需要用到凝胶电泳、密度测定仪等仪器，一些非pcr技术如荧光法等需要昂贵的荧光染料，试剂价格昂贵。

(2)、检测时间短，在2小时内就可完成。而pcr-trap法需要27～72小时。

(3)、稳定性好，可以长时间保存，检测结果肉眼可见。而pcr-trap法及其他众多非pcr法均为液相检测体系，不稳定，难以长时间保存。

在完成发明的过程中，选择人hela宫颈癌细胞、鼠肠上皮细胞iec-18作为检测目标物，对所述的基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰纤维化纸传感器进行测试。结果表明，制备得到的亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰纤维化纸传感器对于hela宫颈癌细胞有阳性结果显示，而对于鼠肠上皮细胞iec-18阴性结果显示，检测癌细胞在0-100cells/μl范围内呈现良好的线性关系(r＝0.99)。

附图说明

图1为上转换纳米粒子ucnps的tem、hrtem图；

图2为上转换纳米粒子ucnps修饰捕捉适配体(te)后的紫外-吸收图及上转换荧光图；

图3为基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰的纤维化纸传感器对人hela宫颈癌细胞、鼠肠上皮细胞iec-18检测结果图；

图4为基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰的纤维化纸传感器对人hela宫颈癌细胞检测结果线性关系图；

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。

实施例1：修饰纤维化纸传感器的制备

实验材料：普通纤维化滤纸，标准gb/t1914-2007，泰州金奥滤纸公司；无水氯化锂(licl)，批号为f20130906，上海埃彼化学试剂有限公司；高碘酸钠(naio4)，批号sb0875，生工生物工程(上海)股份有限公司；适配体序列为：ts-nh2：5’-nh2(ch2)6ttttttaatccgtcgagcagagtt-3’，生工生物工程(上海)股份有限公司。

实验仪器及设备：kq-500de超声波清洗器、dhg-9143bs电热鼓风干燥箱、ay120电子分析天平、tgl-16c离心机。

实验过程：

(1)纤维化纸的预处理

在250ml烧杯中，将0.4glicl和1.0gnaio4充分溶解于200ml蒸馏水中，将纤维化纸裁剪成15*15mm大小浸泡于烧杯中，在60℃下水浴加热60分钟，取出纸片，用蒸馏水反复洗涤三次后，置于烘箱50℃下干燥，即得氧化、干燥的纤维化纸。

(2)纤维化纸传感器基板的制备

将厚度为2mm的亚克力板材加工成15*15mm，中央开有孔径为5mm圆孔的薄片，将一片步骤(1)所得氧化的纤维化纸放入两片亚克力板材中固定，于紫外线下灭菌30分钟，即得纤维化纸传感器基板。

(3)纤维化纸传感器基板的修饰

将20μl浓度为50mm，ph为8.0含有5μmts-nh2溶液和50mmnacnbh3溶液的hepes缓冲溶液，少量多次滴加于步骤(2)所得的纤维化纸基板中央凹槽中，然后在37℃下培育60分钟，培育结束后，先用pbs缓冲溶液轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，冻干备用，即得修饰后的纤维化纸传感器基板。

实施例2：端粒互补寡核苷酸(tc-nh2)修饰上转换纳米粒

实验材料：牛血清白蛋白，批号为140318，上海阿拉丁试剂有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)，批号090m14531v，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(nhs)，批号mkbg7914v，上海阿拉丁试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。捕捉适配体序列为：tc-nh2：捕捉适配体(tc-nh2)：5’-ccctaaccctaaaaaa(ch2)3nh2-3’，生工生物工程(上海)股份有限公司。

实验仪器及设备：kq-500de超声波清洗器、dhg-9143bs电热鼓风干燥箱、ay120电子分析天平、tgl-16c离心机。

实验过程：将1ml浓度为1mg/ml的羧基化上转换纳米粒子(ucnps)用25mm，ph为6的mes缓冲溶液洗涤两次后离心，取上清液，滴加100μl浓度为5mg/ml的edc溶液与100μl浓度为5mg/ml的nhs溶液，室温下缓慢振摇60分钟后，滴加78μl浓度为100μm的端粒互补寡核苷酸(捕捉适配体tc-nh2)，室温下孵育18小时。孵育结束后，用50000分子量超滤管超滤，取上层用tris-hcl缓冲液稀释后离心，重复两次，弃液体，用含0.1％bsa的ph为7.4的pbs缓冲液洗涤三次，即得胺基化的端粒互补寡核苷酸修饰上转换纳米粒子溶液。进行tem、hrtem以及紫外、荧光表征。如图1，图2所示。

实施例3：选择人宫颈癌细胞(hela细胞)为研究目标物，对所述的基于亚甲基蓝、上转换纳米粒修饰纤维化纸传感器进行测试

实验材料：乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。hepes缓冲液，批号为：e607018，购自上海生工生物试剂有限公司；5′-三磷酸腺苷二钠盐三水(atp)，批号为：a600020，购自上海生工生物试剂有限公司；

实验仪器及设备：kq-500de超声波清洗器、dhg-9143bs电热鼓风干燥箱、ay120电子分析天平、tgl-16c离心机。

实验过程：

(1)人宫颈癌细胞端粒酶的提取

取指数生长期的宫颈癌细胞于10ml离心管，用冰预冷的pbs缓冲液洗涤两次，用血球计数板进行计数，将1ml浓度为0cell/μl、20cell/μl、40cell/μl、60cell/μl、80cell/μl、100cell/μl的宫颈癌细胞pbs缓冲液分别装于六支1.5ml离心管中，在4℃，10000g的条件下离心1分钟，弃去上清液。在每支离心管中滴加200μl冰预冷的细胞端粒酶裂解液，在0℃，450转/分钟的条件下于自动匀浆机中培育25分钟后在4℃，16000g的条件下离心20分钟，移取160μl上清液分装于六支新的1.5ml离心管中立即使用或者在-80℃条件下冻存备用。

(2)基于亚甲基蓝的修饰纤维化纸传感器对端粒酶活性的检测

将5μl1×trap缓冲液(含20mm，ph8.3tris-hcl缓冲液，1.5mm氯化镁溶液，63mm氯化钾溶液，0.005％吐温20，1mmegta溶液，0.1mg/mlbsa溶液)，5μl浓度为10mm的dntps溶液，20μl扩增适配体te(5μm)，1μl核苷酸酶抑制剂，5μl步骤(1)六个不同浓度的样品溶液分别滴加于6个所述的修饰纤维化纸基板中央凹槽，在37℃条件下孵育60分钟，孵育结束后，先用20mmph8.0的tris-hcl缓冲液轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，37℃下干燥后，分别滴加20μl捕捉适配体(tc-亚甲基蓝)溶液于凹槽中，在37℃条件下孵育30分钟，孵育结束后，用trap缓冲液轻轻地充分洗涤，37℃条件下干燥，用数码相机拍摄6个纸基板中央凹槽的图片，利用色度分析软件进行分析。

(3)基于上转换纳米粒的修饰纤维化纸基板对端粒酶活性的检测

将5μl1×trap缓冲液(含20mm，ph8.3tris-hcl缓冲液，1.5mm氯化镁溶液，63mm氯化钾溶液，0.005％吐温20，1mmegta溶液，0.1mg/mlbsa溶液)，5μl浓度为10mm的dntps溶液，1μl核苷酸酶抑制剂，20μl扩增适配体te(5μm)和5μl步骤(1)六个不同浓度的样品溶液分别滴加于6个所述的修饰纤维化纸基板中央凹槽，在37℃条件下孵育60分钟，孵育结束后，先用20mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，37℃下干燥后，分别滴加20μl实施例2中的捕捉适配体(tc-上转换纳米粒)溶液于凹槽中，在37℃条件下孵育30分钟，孵育结束后，用trap缓冲液轻轻地充分洗涤，37℃条件下干燥，用数码相机拍摄下近红外光照射中央凹槽处的荧光图片，进行分析。试验结果如图3所示。

实施例4：选择鼠肠上皮细胞iec-18细胞为研究目标物，对所述的基于亚甲基蓝、上转换纳米粒的修饰纤维化纸传感器进行测试

实验材料：乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。hepes缓冲液，批号为：e607018，购自上海生工生物试剂有限公司；5′-三磷酸腺苷二钠盐三水(atp)，批号为：a600020，购自上海生工生物试剂有限公司；

实验仪器及设备：kq-500de超声波清洗器、dhg-9143bs电热鼓风干燥箱、ay120电子分析天平、tgl-16c离心机。

实验过程：

(1)人宫颈癌细胞端粒酶的提取

取指数生长期的鼠肠上皮细胞iec-18细胞于10ml离心管，用冰预冷的pbs缓冲液洗涤两次，用血球计数板进行计数，将1ml浓度为0cell/μl、20cell/μl、40cell/μl、60cell/μl、80cell/μl、100cell/μl的鼠肠上皮细胞iec-18细胞pbs缓冲液分别装于六支1.5ml离心管中，在4℃，10000g的条件下离心1分钟，弃去上清液。在每支离心管中滴加200μl冰预冷的细胞端粒酶裂解液，在0℃，450转/分钟的条件下于自动匀浆机中培育25分钟后在4℃，16000g的条件下离心20分钟，移取160μl上清液分装于六支新的1.5ml离心管中立即使用或者在-80℃条件下冻存备用。

(2)基于亚甲基蓝的修饰纤维化纸传感器对端粒酶活性的检测

将5μl1×trap缓冲液(含20mm，ph8.3tris-hcl缓冲液，1.5mm氯化镁溶液，63mm氯化钾溶液，0.005％吐温20，1mmegta溶液，0.1mg/mlbsa溶液)，5μl浓度为10mm的dntps溶液，20μl扩增适配体te(5μm)，1μl核苷酸酶抑制剂，5μl步骤(1)六个不同浓度的样品溶液分别滴加于6个所述的修饰纤维化纸基板中央凹槽，在37℃条件下孵育60分钟，孵育结束后，先用20mmph8.0的tris-hcl缓冲液轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，37℃下干燥后，分别滴加20μl捕捉适配体(tc-亚甲基蓝)溶液于凹槽中，在37℃条件下孵育30分钟，孵育结束后，用trap缓冲液轻轻地充分洗涤，37℃条件下干燥，用数码相机拍摄6个纸基板中央凹槽的图片，利用色度分析软件进行分析。

(3)基于上转换纳米粒的修饰纤维化纸基板对端粒酶活性的检测

将5μl1×trap缓冲液(含20mm，ph8.3tris-hcl缓冲液，1.5mm氯化镁溶液，63mm氯化钾溶液，0.005％吐温20，1mmegta溶液，0.1mg/mlbsa溶液)，5μl浓度为10mm的dntps溶液，1μl核苷酸酶抑制剂，20μl扩增适配体te(5μm)和5μl步骤(1)六个不同浓度的样品溶液分别滴加于6个所述的修饰纤维化纸基板中央凹槽，在37℃条件下孵育60分钟，孵育结束后，先用20mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液轻轻洗涤三次，再用蒸馏水轻轻洗涤三次，37℃下干燥后，分别滴加20μl实施例2中的捕捉适配体(tc-上转换纳米粒)溶液于凹槽中，在37℃条件下孵育30分钟，孵育结束后，用trap缓冲液轻轻地充分洗涤，37℃条件下干燥，用数码相机拍摄下近红外光照射中央凹槽处的荧光图片，进行分析。试验结果如图3，图4所示。

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。