一种多肽修饰纳米粒子在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种多肽修饰纳米粒子在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。

背景技术：

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种直接(各类型肺炎、异物误吸等)和间接致伤因素(创伤、感染、休克等)引起的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。急性肺损伤早期的特征性表现为肺毛细血管内皮细胞与肺泡上皮细胞屏障的通透性增高，肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液，其中富含蛋白及以中性粒细胞为主的多种炎症细胞。中性粒细胞黏附在受损的血管内皮细胞表面，进一步向间质和肺泡腔移行，释放大量促炎介质，如炎症性细胞因子、过氧化物、白三烯、蛋白酶、血小板活化因子等。除炎症细胞外，肺泡上皮细胞以及成纤维细胞也能产生多种细胞因子，从而加剧炎症反应过程。凝血和纤溶紊乱也参与急性肺损伤的病程，急性肺损伤早期促凝机制增强，而纤溶过程受到抑制，引起广泛血栓形成和纤维蛋白的大量沉积，导致血管堵塞以及微循环结构受损。急性肺损伤的治疗包括原发病的治疗、呼吸支持治疗等，目前临床上也不断出现新的治疗方法，有些是抑制炎症因子，减轻炎症反应的，有些是改善氧合，纠正缺氧，有些是促进肺内液体的吸收。这些方法的药物有酮康唑、己酮可可碱、利索茶碱、抗氧化剂、集落细胞刺激因子、表面活性物质、液体通气、一氧化氮、活化蛋白C等，但仍然需要更深入的研究，进行大型的临床试验来验证。

基于多肽的纳米药剂是近些年研究较多的新型药物制剂，其具备可靶向作用于特定细胞，具有较好的体内分布和细胞穿透性，便于对药物进行体内追踪，延长药物释放等一系列优点。

目前还未见应用多肽修饰纳米粒子治疗急性肺损伤的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽修饰纳米粒子的应用。

一方面，本发明提供了一种多肽修饰纳米粒子在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如SEQ ID NO:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。

另一方面，本发明提供了一种多肽修饰纳米粒子在制备急性肺损伤的抗炎药物中的应用，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如SEQ ID NO:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。

再一方面，本发明提供了一种多肽修饰纳米粒子在制备急性肺损伤中后期的肺损伤修复药中的应用，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如SEQ ID NO:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。

第四方面，本发明提供了一种多肽修饰纳米粒子在制备体外研究中性粒细胞迁移机制的试剂中的应用，所述的多肽修饰纳米粒子是序列如SEQ ID NO:1所示的多肽修饰的金纳米粒子。

本文中，所述序列如SEQ ID NO:1所示的多肽修饰的金纳米粒子代号为P12。

本发明优点在于：

急性肺损伤是发病率和病死率均较高的可由直接或间接因素导致的肺部疾病，其发生发展伴随炎症反应。炎症反应是一种由多种信号传导通路调节的复杂的病理过程，在不同的损伤类型、不同的组织、不同的时间，不同的淋巴细胞(包括中性粒细胞)的迁移所受到的信号都是特异的，因此临床上针对不同部位炎症的选药也有所不同。本发明首次通过体内实验证实了由CLPFFD修饰的金纳米粒子对于急性肺损伤具备确切的抗炎作用，并能有效促进急性肺损伤中后期的肺损伤修复，因此可用于制备治疗急性肺损伤的药物，该药物具有疗效显著、可靶向作用于特定细胞、体内分布和细胞穿透性较好、便于体内追踪等优点，本发明为急性肺损伤的治疗提供了一种新途径。

本发明经体外实验还发现由CLPFFD修饰的金纳米粒子能够有效抑制中性粒细胞的迁移。中性粒细胞迁移是中性粒细胞重要的生物学功能之一，也是中性粒细胞由骨髓或外周血趋化到病变部位活化并履行功能的必经步骤。因此本发明将有助于研究中性粒细胞迁移的相关作用机制。

附图说明

图1.P12可有效抑制中性粒细胞迁移。(a)显微镜下观察人外周血提取的中性粒细胞；(b-c)CFSE标记的中性粒细胞在有无IL-8条件下迁移的荧光显微成像图；(d)定量分析CFSE标记的中性粒细胞对IL-8的迁移(n＝3)；(e)P12能显著地抑制IL-8(5ng/mL)介导的中性粒细胞迁移，但是P13不能。另外，在无IL-8情况下，纳米粒子本身对中性粒细胞迁移无显著影响(n＝2)。

图2.P12能有效抑制LPS诱导的小鼠ALI炎症反应。(a)P12有效地降低肺泡灌洗液中炎性细胞的浸润；(b)P12有效地降低肺泡灌洗液中中性粒细胞的迁移；(c-f)从组织病理H&E染色上看，P12有效地减低肺部的炎症，包括降低肺泡水肿、肺泡壁增厚和炎性细胞的迁移；(g)从H&E染色肺损伤程度的评分来看，P12可以显著地降低LPS诱导的急性炎症，而P13不能。PBS对照组(N＝3)，其它组(N＝6)。

图3.P12促进LPS诱导ALI小鼠模型中Treg细胞纵隔淋巴结迁移。(a-c)纵膈淋巴结免疫组化Foxp3染色图(400×)，LPS 10mg/kg，t＝24h；(d)定量分析Foxp3+细胞在每个视野中的数量，随机对每张切片选择2个高倍视野(400×)计数阳性细胞，N＝6只/组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 P12的制备

金纳米粒子的合成是采用柠檬酸钠还原氯金酸方法，具体操作方法如下：将6.45mL氯金酸(10.5mg/mL)加入盛有200mL MiliQ水(18.2MΩ)的锥形瓶，在加热搅拌台上加热至沸后，迅速加入2mL柠檬酸钠(10％)，继续加热搅拌15分钟后，搅拌冷却至室温。多肽(Pep 12：CLPFFD(SEQ ID NO:1)，纯度>95％)粉末溶于水配制成多肽溶液(1mM)。将多肽和金纳米粒子溶液按1:10体积比混合，静置过夜。采用220nm注射器滤头，过滤多肽金纳米粒子悬液，然后离心(15000rpm，30min)，再采用PBS清洗三次，重新浓缩至1mM待用。

制备得到的多肽修饰纳米粒子即在金纳米粒子的表面通过与多肽上的-SH基形成类似于共价键的Au-S键连接上Pep 12。

实施例2体外试验证明P12可以阻止中性粒细胞迁移

1、实验方法

抽取人外周静脉血20ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞。将含有红细胞的底层取出与同体积的3％葡聚糖混合轻轻摇匀，室温下自然沉降1h，取Dextran沉淀后的“上清部分”，在150g下离心8min，重新悬浮在0.2％的NaCl中，1min后加等体积的1.6％的NaCl，150g离心8min，以移除红细胞得到中性粒细胞，并将其悬浮于PBS中计数，加CFSE(5μM)，将细胞置于37度30min后离心，用含2％FBS PBS洗2次，并将其悬浮于RPMI1640培养基(含10％胎牛血清，5×10⁶/mL)。

将悬挂式细胞培养小室置于24孔板上，在孔内加0.5mL RPMI1640培养基(阴性对照)，IL-8液(阳性对照)或IL-8+P12/P13悬液(P13为另一种多肽CLPAAD(SEQ ID NO:2)修饰的金纳米粒子，制备方法同实施例1)，再在小室内加200μl CFSE标记的中性粒细胞。4h后取出小室，采用荧光显微镜观察孔内中性粒细胞的迁移情况，并将孔内溶液取出，采用多功能酶标仪分析其荧光强度，以定量分析中性粒细胞在不同环境下的迁移情况。

2、实验结果

通过体外实验，从人外周血提取中性粒细胞，并采用CFSE荧光染色方法，可以分析P12对IL-8介导的中性粒细胞迁移的影响。数据显示P12可以显著地抑制IL-8介导的中性粒细胞迁移(图1)。

实施例3体内实验证实P12可以有效治疗急性肺损伤

1、实验方法

构建急性肺损伤小鼠模型。选取雄性、6-8周龄SPF级C57BL6小鼠，称量体重。予5％水合氯醛，按6μl/g剂量腹腔注射以麻醉，后予仰卧位固定于操作台，于无菌条件下持眼科剪剪除颈部毛发，75％医用酒精棉球消毒颈部皮肤三次，行颈部皮肤切开约0.5cm长度，无菌眼科镊逐层剥离组织，暴露气管。选用1ml注射器，吸取无菌LPS(sigma公司)，对照组选用无菌PBS溶液，行气管穿刺，回抽见气体后，按10mg/kg缓慢注入LPS。LPS滴注前1h，滴注50μL悬于PBS中P12和P13(1μM)。注射完毕后拔除注射器，逐层缝合颈部，将小鼠按俯卧位头高脚低送回饲养笼继续饲养，记录编号、体重、麻醉剂量及LPS剂量，24小时后处死取材。

将颈部和胸部解剖，气管和右肺叶结扎，将穿刺针插入气管上端，用注射器注入0.3ml PBS至右肺内，停留30s左右，进行单侧灌洗，一般反复冲洗3遍，每遍冲洗3次。将回抽灌洗液盛入1.5ml的EP管(置于冰浴中)，可回收0.65ml肺灌洗液；将标本容积计量后，在4℃下离心(1500r/min)10min，上清液分装后置于-80℃保存，细胞沉渣重新悬浮于1或0.5mL PBS进行有核细胞直接计数与涂片；待玻片自然晾干，然后置于10％中性甲醛溶液中固定10分钟以上，进行常规HE染色。收集小鼠的BALF，在BALF中细胞计数检测总浸润细胞数，及中性粒细胞、单核-巨噬细胞及淋巴细胞的数量。右肺要用4％的多聚甲醛固定组织，进行H&E染色。收集小鼠的纵膈淋巴及并置于10％中性甲醛溶液中固定10分钟以上，进行常规HE染色。

2、实验结果

采用LPS诱导小鼠急性肺损伤模型，我们验证了气道滴注的P12可以有效地抑制炎性细胞在肺泡中的浸润和阻止中性粒细胞的迁移(图2中a-b)。通过H&E染色分析肺组织病理和进行组织损伤评分，证实P12可以有效地减低LPS诱导的肺部炎症反应，包括降低肺泡水肿、肺泡壁增厚、炎性细胞的迁移(图2中c-g)。由此可见，P12对LPS诱导的小鼠ALI具有确切和显著的抗炎效用。

此外，通过对纵膈淋巴结免疫组化Foxp3染色分析，发现相较于LPS对照组和P13治疗组，P12治疗组小鼠纵膈淋巴结中Treg细胞数显著提高(图3)。该研究结果表明，P12可以诱导Treg细胞向肺部迁移，从而促进ALI中后期的肺损伤修复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

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<110> 上海市第一人民医院

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