本发明涉及一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法。
背景技术：
纳米粒是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，已经成为药物新剂型研究中非常活跃的领域。目前研究已由传统的表面未经修饰纳米粒子逐渐转变为具有多功能的复合纳米粒子。叶酸(FA)常被用来作为肿瘤靶向分子，具有无毒、稳定和免疫原性弱等优势。叶酸与叶酸受体(FR)结合力强并且对肿瘤细胞具有很高的选择性。药物通过与叶酸偶联可提高药物对肿瘤细胞的靶向性，降低对正常细胞的毒性。研究表明，山核桃仁中鞣质成分具有显著的抗肿瘤作用。但由于稳定性较差，影响了它的应用。为了开发适合于临床应用的山核桃仁鞣质制剂，本实验以脂质纳米粒为载体，采用FA-PEG对其表面修饰构建肿瘤靶向给药系统，具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现要素：
本发明提出一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法。
一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取叶酸(FA)65．8mg溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)62mg和三乙胺(TEA)120μL搅拌均匀再加入400mgH2NPEG-NH2(n(FA)∶n(H2N-PEG-NH2)∶n(DCC)∶n(TEA)＝1∶0．8∶2∶5)，室温下避光反应24h，减压回收三乙胺后过0．45μm有机滤膜，即得FA-PEGNH2粗品；
（2）取FA-PEG-NH2粗品加入45mL冷氯仿混匀，过滤除去未反应的FA及副产物FA-PEG-FA旋转蒸发除去有机溶剂氯仿，去离子水透析48h去除DMSO，经冷冻干燥后得FA-PEG-NH2；
（3）称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg和FA-PEG-NH2100mL用适量的无水乙醇溶解，溶液加入到250mL圆底烧瓶中减压旋转蒸发去除乙醇，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；
（4）加入适量蒸馏水和山核桃仁鞣质16mg，旋转洗膜15min，将洗液置于25mL的烧杯中磁力搅拌1.5-2.5h，然后超声5min，冷冻干燥，即得山核桃仁鞣质FA-PEG修饰纳米粒。
如权利要求1所述一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）的搅拌时间为2h。
利用如权利要求1所述一种山核桃仁鞣质纳米粒方法制备山核桃仁鞣质普通纳米粒的方法，其特征在于，包括以下制备步骤：称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg用适量的无水乙醇溶解，溶液加入到250mL的容量瓶中进行减压旋转蒸发除去乙醇使其成膜，加入适量的生理盐水和山核桃仁鞣质16mg旋转洗膜15min，将洗液置于25mL的烧杯中磁力搅拌2h，然后超声2-10min，冷冻干燥，即得山核桃仁鞣质普通纳米粒。
利用如权利要求1所述一种山核桃仁鞣质纳米粒方法制备山核桃仁鞣质普通纳米粒的方法，其特征在于：所述超声时间为5分钟。
本发明所述方法制备的山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒平均粒径为166.8nm；包封率为74.5％，粒子呈大小均匀的球形；放置50d纳米粒粒径和包封率变化轻微，具有很好的稳定性；叶酸-PEG 修饰纳米粒小鼠尾静脉注射后0.25，1和4h 肿瘤分布分别为20.8％，36.5％和50.2％，具备明显的肿瘤靶向作用。
具体实施方式
实施例1。
一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取叶酸(FA)65．8mg溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)62mg和三乙胺(TEA)120μL搅拌均匀再加入400mgH2NPEG-NH2(n(FA)∶n(H2N-PEG-NH2)∶n(DCC)∶n(TEA)＝1∶0．8∶2∶5)，室温下避光反应24h，减压回收三乙胺后过0．45μm有机滤膜，即得FA-PEGNH2粗品；
（2）取FA-PEG-NH2粗品加入45mL冷氯仿混匀，过滤除去未反应的FA及副产物FA-PEG-FA旋转蒸发除去有机溶剂氯仿，去离子水透析48h去除DMSO，经冷冻干燥后得FA-PEG-NH2；
（3）称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg和FA-PEG-NH2100mL用适量的无水乙醇溶解，溶液加入到250mL圆底烧瓶中减压旋转蒸发去除乙醇，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；
（4）加入适量蒸馏水和山核桃仁鞣质16mg，旋转洗膜15min，将洗液置于25mL的烧杯中磁力搅拌1.5-2.5h，然后超声5min，冷冻干燥，即得山核桃仁鞣质FA-PEG修饰纳米粒。
实施例2。
一种山核桃仁鞣质叶酸修饰纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）取叶酸(FA)65．8mg溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)62mg和三乙胺(TEA)120μL搅拌均匀再加入400mgH2NPEG-NH2(n(FA)∶n(H2N-PEG-NH2)∶n(DCC)∶n(TEA)＝1∶0．8∶2∶5)，室温下避光反应24h，减压回收三乙胺后过0．45μm有机滤膜，即得FA-PEGNH2粗品；
（2）取FA-PEG-NH2粗品加入45mL冷氯仿混匀，过滤除去未反应的FA及副产物FA-PEG-FA旋转蒸发除去有机溶剂氯仿，去离子水透析48h去除DMSO，经冷冻干燥后得FA-PEG-NH2；
（3）称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg和FA-PEG-NH2100mL用适量的无水乙醇溶解，溶液加入到250mL圆底烧瓶中减压旋转蒸发去除乙醇，在烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜；
（4）加入适量蒸馏水和山核桃仁鞣质16mg，旋转洗膜15min，将洗液置于25mL2h，然后超声5min，冷冻干燥，即得山核桃仁鞣质FA-PEG修饰纳米粒；
（5）称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg用适量的无水乙醇溶解，溶液加入到250mL的容量瓶中进行减压旋转蒸发除去乙醇使其成膜，加入适量的生理盐水和山核桃仁鞣质16mg旋转洗膜15min，将洗液置于25mL的烧杯中磁力搅拌2h，然后超声2-10min，冷冻干燥，即得山核桃仁鞣质普通纳米粒，所述超声时间为5分钟。