一种新型的透明质酸修饰的多级纳米颗粒及其制备与应用的制作方法

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种纳米材料的富集作用和激光解析电离质谱的分子检测应用技术。

背景技术：

传统的对血清的分析方法主要是涉及蛋白、基因和肽段，质谱系统可以高灵敏度、高分辨率测定未知分子的荷质比，并通过串级质谱(tandem mass)对已测得的分子进行测序、研究其后翻译修饰作用。从原理上来说，质谱分析能够直接鉴定生物样品的分子组成；但在实际测试中，由于部分蛋白和多肽分子低丰度表达且样品过于复杂，质谱分析所获取的信息往往不够全面，使得传统的检测方法受到很大的限制，从而限制了其在医学诊断中的应用。因此，在现阶段的研究方法中，生物样品的预处理已经成为了决定质谱分析效率的关键性步骤，其中基于纳米材料的样品预处理是当前热点领域，而成为检测分析的一种优选手段。在实际的生物体系当中，生物样品通常十分复杂。各种生物大分子的存在，这些都会对蛋白分子的检测带来阻碍。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新型的透明质酸修饰的多级纳米颗粒，并将其应用于从生物样品中富集低丰度的蛋白，辅助生物样品的质谱检测。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由N-乙酰氨基葡糖和β-D-葡糖醛酸二糖单元交替联接而成的线状酸性黏多糖，透明质酸的主要受体之一是CD44分子，在肿瘤部位或炎症组织的细胞表面均会过度表达。现在主要使用HA修饰的载体作为纳米靶向载体，提高药物传递的靶向性。本发明使用了一种新型的多级纳米材料，其表面粗糙，相对表面积较大，使用透明质酸特异性的表面修饰后，能代替抗原捕获可相互作用的蛋白分子。通过采用透明质酸修饰的多级纳米的颗粒材料辅助富集低丰度蛋白，能够克服传统血清分子检测中复杂性的问题，快速、准确地定量检测血清中蛋白分子。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种透明质酸修饰的多级纳米颗粒，该多级纳米颗粒为一级以上的多层二氧化硅颗粒，具有粗糙表面，多级纳米颗粒的外表面由透明质酸修饰，多级纳米颗粒的粒径小于等于1mm。

进一步地，多级纳米颗粒为单层的一级二氧化硅颗粒、两层的二级二氧化硅颗粒、三层的三级二氧化硅颗粒和四层的四级二氧化硅颗粒中的一种或多种。

本发明还提供了一种透明质酸修饰的多级纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、使用乙醇、氨水、TEOS制备不同粒径的一级二氧化硅颗粒，其中第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-60nm、第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为100-500nm、第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-3.5μm；

步骤2、将步骤1中得到的一级二氧化硅颗粒在乙醇溶液中超声，直到一级二氧化硅颗粒分散均匀；

步骤3、将步骤1中得到的所述第二级二氧化硅颗粒用3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的第二级二氧化硅颗粒与第一级二氧化硅颗粒加入超纯水(即电阻率达到18MΩ*cm(25摄氏度)的水)中，并在20-100摄氏度下反应12-24小时，以制备类似于病毒结构的二级二氧化硅颗粒；

步骤4、将步骤1中得到的第三级二氧化硅颗粒和步骤3中得到的二级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的第三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的二级二氧化硅颗粒，在20-65摄氏度下进行酯化反应，以制备三级二氧化硅颗粒；

步骤5、将步骤4中得到的三级二氧化硅颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的三级二氧化硅颗粒与丁二酸酐加入到富马酸二甲脂溶液中进行羧基化修饰，然后将羧基化修饰后的三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入粒径范围为0.5-1mm的玻璃颗粒进行酯化反应，制备四级二氧化硅颗粒；

步骤6、将步骤1至5中得到的一级二氧化硅颗粒、二级二氧化硅颗粒、三级二氧化硅颗粒和四级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的一级二氧化硅颗粒、二级二氧化硅颗粒、三级二氧化硅颗粒和四级二氧化硅颗粒进行酯化反应制备表面经透明质酸修饰的多级纳米颗粒。

进一步地，用于制备四级二氧化硅颗粒的一级二氧化硅颗粒的优选为：第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-20nm，第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为150-200nm，第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-1.5μm。

进一步地，氨基化修饰的反应温度为80-120摄氏度，回流反应时间为10-24小时；羧基化修饰的反应温度为20-60摄氏度，反应时间为12-24小时；酯化反应的反应温度为20-65摄氏度。

本发明还提供了上述透明质酸修饰的多级纳米颗粒在质谱检测生物样品中的应用。

进一步地，透明质酸修饰的多级纳米颗粒用于富集癌细胞蛋白以用于质谱检测。

更进一步地，癌细胞蛋白为CD44受体蛋白。

本发明还提供了一种从血清中富集CD44受体蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1、根据上述方法制备透明质酸修饰的多级纳米颗粒；

步骤2、稀释血清样品(×10)，加入步骤1中制备的透明质酸修饰的多级纳米颗粒，充分混合(10-24小时)，得到富集后的CD44受体蛋白。

本发明还提供了一种利用质谱检测血清中的CD44受体蛋白的方法，其特征在于，方法包括以下步骤：

步骤1、仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，采用线性反射模式，正离子检测；

步骤2、根据上述方法从血清中富集CD44受体蛋白；

步骤3、离心分离得到上清液，进行胰蛋白酶处理；

步骤4：将处理后的样品在质谱靶板上点样，室温下干燥，采用内标法对血清样品中的小分子进行定量分析检测；

步骤5：对质谱检测结果进行分析，得出结论。

本发明的有益效果在于：多级纳米级的颗粒基质制备成本低，可以大批量制作，合成步骤简单；该级纳米级的颗粒表面粗糙，相对表面积较大，并使用透明质酸修饰，能够去除生物样品(例如血清)中其它杂质蛋白的干扰。本发明只需消耗少量生物样品(例如血清)，在透明质酸修饰的多级纳米材料的富集、分离操作的前提下即可快速、准确地定量检测分析生物样品(例如血清)中的特异癌症蛋白；整个检测过程步骤简单、成本低，可应用于临床中。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是本发明较优实施例中制备得到的多级纳米颗粒的SEM表征图片：图1a为1mm的纳米颗粒SEM表征图片；图1b为10um的三级纳米颗粒(表面具有二级纳米颗粒)SEM表征图片；图1c为大于1000nm的纳米颗粒表面的200nm左右纳米(二级纳米颗粒)SEM表征图片；

图2是傅里叶红外光谱图标记出多级纳米颗粒表面修饰的透明质酸波谱；

图3是电化学检测未修饰和修饰透明质酸的多级纳米颗粒结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

步骤1、使用乙醇、氨水、TEOS制备不同粒径的一级二氧化硅颗粒，其中第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-60nm、第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为100-500nm、第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-3.5μm；

步骤2、将步骤1中得到的一级二氧化硅颗粒在乙醇溶液中超声，直到一级二氧化硅颗粒分散均匀；

步骤3、将步骤1中得到的所述第二级二氧化硅颗粒用3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的第二级二氧化硅颗粒与第一级二氧化硅颗粒加入超纯水中，并在20-100摄氏度下反应12-24小时，以制备二级二氧化硅颗粒；

步骤4、将步骤1中得到的第三级二氧化硅颗粒和步骤3中得到的二级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的第三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的二级二氧化硅颗粒，在20-65摄氏度下进行酯化反应，以制备三级二氧化硅颗粒；

步骤5、将步骤4中得到的三级二氧化硅颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的三级二氧化硅颗粒与丁二酸酐加入到富马酸二甲脂溶液中进行羧基化修饰，然后将羧基化修饰后的三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入粒径范围为0.5-1mm的玻璃颗粒进行酯化反应，制备四级二氧化硅颗粒；

步骤6、将步骤1至5中得到的一级二氧化硅颗粒、二级二氧化硅颗粒、三级二氧化硅颗粒和四级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的一级二氧化硅颗粒、二级二氧化硅颗粒、三级二氧化硅颗粒和四级二氧化硅颗粒进行酯化反应制备表面经透明质酸修饰的多级纳米颗粒。

使用各种一级二氧化硅颗粒从小粒径到大粒径逐级合成各种两层的二级二氧化硅颗粒、三层的三级二氧化硅颗粒和四层的四级二氧化硅颗粒。根据稳定性和相对表面积增加的最优化原则，用于制备四级二氧化硅颗粒的一级二氧化硅颗粒的优选为：第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-20nm，第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为150-200nm，第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-1.5μm。使用这些粒径范围内的一级二氧化硅颗粒制备得到的四级二氧化硅颗粒，具有最佳的稳定性和适宜于捕获特定蛋白的表面积。

上述制备步骤中，氨基化修饰的反应温度为80-120摄氏度，回流反应时间为10-24小时；羧基化修饰的反应温度为20-60摄氏度，反应时间为12-24小时；酯化反应的反应温度为20-65摄氏度。

多级纳米材料的表征：

表征所用仪器有：采用JEOL JEM-2100F仪器获得透射电镜图片、高分辨透射电镜图片以及选区电子衍射花样；采用硅片制备扫描电镜样品，并通过Hitachi S-4800仪器获得扫描电镜图片；接触角采用EasyDrop装置KRUSS GmbH,Germany获得。

表征结果为：

所获得的纳米颗粒材料为球形，最终纳米颗粒尺寸小于等于1mm。通过透射电镜图片可以看出，颗粒材料具有亚单元结构，并且通过选取颗粒材料边缘区域放大可以看出，表面是由有更多的纳米颗粒材料组成。根据测得的扫描电镜图片(如图1所示)，可以看出颗粒材料表面呈现粗糙状，并且尺寸均一。由傅里叶红外光谱可知，功能修饰的纳米颗粒材料的在1480区域具有很好的吸收峰，表示透明质酸已修饰在多级纳米材料表面。图2是傅里叶红外光谱图标记出多级纳米颗粒表面修饰的透明质酸波谱。图3是电化学检测未修饰(Control)和修饰不同浓度(1ng/ml-10⁴ng/ml)透明质酸的多级纳米颗粒捕获CD44蛋白后电流的变化，可以发现修饰后的多级纳米材料电流明显变化，说明经透明质酸修饰的多级纳米颗粒成功捕获到了CD44蛋白。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。