用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备及检测方法与流程

本发明涉及功能复合材料技术领域，特别涉及一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备及检测方法。

背景技术：

DNA检测在临床诊断、基因变异识别、医学研究等领域显示出良好的应用前景，引起了广泛关注。用于DNA检测的方法包括PCR检测技术，免疫测定，质谱法等，虽然这些方法很方便，但它们的检测限较低，限制了其应用。其中，光学检测法以其高灵敏度、操作简单、实时检测等优势发展较快。常用于DNA检测的光学材料包括金纳米粒子，量子点，荧光共轭聚合物等，其中控制金纳米粒子形貌以及改善量子点的生物相容性较为复杂。荧光共轭聚合物具有“分子导线”效应，相对于其他材料可以成倍的提高检测灵敏度。目前已有报道表明，利用阳离子型水溶性共轭聚合物同荧光分子标记的核苷酸探针之间的荧光共振能量转移效应实现检测信号的放大。

近年来，基于共轭聚合物的荧光纳米粒子已发展成为基因检测和生物分析的有效工具。共轭聚合物易于亲水性修饰和功能化处理，其中由较少的结构单元组成的共轭寡聚物，分子量介于小分子和共轭聚合物之间。它既具有小分子结构可控、易纯化等优点，又具有共轭聚合物的高稳定性。共轭寡聚物共轭结构规整，因此具有独特的光电性能。其自组装形成的纳米粒子在细胞内拥有亮度高和光稳定性好等优点，因此，制备一种简单实用，能够灵敏检测DNA的荧光复合纳米粒子是十分必要的。

基于以上现状，发明一种新型荧光复合纳米粒子用于基因检测，将染料标记的寡核苷酸序列与荧光共轭寡聚物复合形成纳米粒子，利用荧光共振能量转移效应实现不同碱基数目的DNA的检测对生物检测领域具有十分重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是克服现有DNA检测体系在检测DNA时，操作繁琐，荧光强度低，检测不灵敏等缺陷，提供一种荧光复合纳米粒子的制备方法，可以用于简单有效地检测不同碱基数目的DNA。

本发明的技术方案是通过共沉淀作用，将侧链修饰有碱基的共轭寡聚物溶液与荧光染料修饰的寡核苷酸序列溶液混合，随后过滤即得到荧光复合纳米粒子；如图1所示。该复合纳米粒子具有明显的荧光共振能量转移效应产生。将待测DNA加入复合纳米粒子溶液后，观测荧光共振能量转移信号变化，检测不同碱基数目的DNA。

本发明提供了一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将侧链修饰有碱基的共轭寡聚物溶于有机溶剂中，得到溶液A；将染料标记的寡核苷酸序列溶于超纯水中，得到溶液B；

步骤二、将溶液A快速注入溶液B，混合均匀，用过滤膜过滤即得到含有荧光复合纳米粒子的溶液C。

进一步的，步骤一中，所述侧链修饰有碱基的共轭寡聚物选自具有式(1)-(4)的荧光共轭寡聚物中的一种或多种：

进一步的，步骤一中，所述有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺的一种或多种。

进一步的，步骤一中，用于标记所述寡核苷酸序列的染料为Rhodamine B,Texas Red，X-rhodamine,Naphthofluorescein,Cy3，Cy3.5，Cy5中的一种。

进一步的，步骤一中，所述染料标记的寡核苷酸序列碱基数目为5-10个。

进一步的，步骤一中，所述溶液A的浓度为1-2×10^-3M；所述溶液B的浓度为1-2×10^-8M。

进一步的，步骤二中，所述溶液A与溶液B体积比为1：100-1：1000。

进一步的，步骤二中，所述过滤膜为聚偏二氟乙烯过滤膜、聚四氟乙烯过滤膜、聚醚砜过滤膜或尼龙过滤膜中的一种或多种。

进一步的，步骤二中得到的荧光复合纳米粒子的粒径为60—120nm。

本发明还提供了一种利用上述荧光复合纳米粒子进行DNA检测的方法，包括如下步骤：

(1)将待检测DNA分别加入到所述溶液C中，保持5—30分钟；

(2)采用荧光光谱仪测试DNA加入前后溶液C的荧光强度，荧光共振能量转移效率高的待测样为碱基数目少的DNA，荧光共振能量转移效率低的待测样为碱基数目多的DNA。

进一步的，步骤(1)中，所述待测DNA为不同碱基数目的单链DNA、双链DNA、扩增前后的DNA或酶切前后的DNA。

进一步的，步骤(1)中，所述待测DNA的浓度为1×10-6M—2×10-5M。

进一步的，步骤(1)中，所述待测DNA的溶液体积为1—20μL。

本发明的有益效果为：荧光复合纳米粒子由共沉淀作用制得，粒径均一，分散性好，对于不同碱基数目的DNA荧光信号变化特征明显；与现有技术相比，操作简单，制备时间短，并且检测的DNA无需荧光标记，成本低廉；采用侧基亲水性修饰的共轭寡聚物，水溶性较好；利用共轭寡聚物和寡核苷酸序列上标记染料之间的荧光共振能量转移效率变化检测DNA，荧光信号变化明显，检测灵敏度提高；所制备的荧光复合纳米粒子结构规整，具有独特的荧光性能及良好的生物兼容性，其在生物检测领域具有很好的实际应用价值。

附图说明

图1所示为本发明实施例中荧光复合纳米粒子的结构示意图。

图2所示为制得的荧光复合纳米粒子的电镜照片。

图3所示为荧光复合纳米粒子用于检测酶切前后DNA的Intensity-wavelength图。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中，各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件，可应用于不同实施例中。

本发明实施例一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将侧链修饰有碱基的共轭寡聚物溶于有机溶剂中，得到溶液A；将染料标记的寡核苷酸序列溶于超纯水中，得到溶液B；

步骤二、将溶液A快速注入溶液B，混合均匀，用过滤膜过滤即得到含有荧光复合纳米粒子的溶液C。

步骤一中，所述侧链修饰有碱基的共轭寡聚物选自具有式(1)-(4)的荧光共轭寡聚物中的一种或多种：

步骤一中，所述有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺的一种或多种。用于标记所述寡核苷酸序列的染料为Rhodamine B,Texas Red，X-rhodamine,Naphthofluorescein,Cy3，Cy3.5，Cy5中的一种。所述染料标记的寡核苷酸序列碱基数目为5-10个；所述溶液A的浓度为1-2×10^-3M；所述溶液B的浓度为1-2×10^-8M。

步骤二中，所述溶液A与溶液B体积比为1：100-1：1000；所述过滤膜为聚偏二氟乙烯过滤膜、聚四氟乙烯过滤膜、聚醚砜过滤膜或尼龙过滤膜中的一种或多种；步骤二中得到的荧光复合纳米粒子的粒径为60—120nm。

本发明实施例一种利用上述荧光复合纳米粒子进行DNA检测的方法，包括如下步骤：

(1)将待检测DNA分别加入到所述溶液C中，保持5—30分钟；

(2)采用荧光光谱仪测试DNA加入前后溶液C的荧光强度，根据荧光强度与荧光共振能量转移效率的关系，荧光共振能量转移效率高的待测样为碱基数目少的DNA，荧光共振能量转移效率低的待测样为碱基数目多的DNA。

步骤(1)中，所述待测DNA为不同碱基数目的单链DNA、双链DNA、扩增前后的DNA或酶切前后的DNA；所述待测DNA的浓度为1×10-6M—2×10-5M；所述待测DNA的溶液体积为1—20μL。

实施例1

一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将侧链修饰有碱基腺嘌呤的荧光共轭寡聚物OFBT-A溶于四氢呋喃溶液中，得到浓度为2×10^-3M的溶液A；Texas Red标记的5个碱基的寡核苷酸序列溶于超纯水中，得到浓度为1.5×10^-8M的溶液B；

(2)将5μL溶液A迅速注入1mL溶液B中，混匀均匀，用聚偏二氟乙烯过滤膜过滤得到荧光复合纳米粒子的溶液C；

(3)将1μL浓度为1×10^-5M的不同碱基数目的单链DNA分别加入到步骤(2)所述的溶液C中，作用10分钟；

(4)采用荧光光谱仪测试DNA加入前后溶液C的荧光强度，荧光共振能量转移效率高的待测样为碱基数目少的DNA，荧光共振能量转移效率低的待测样为碱基数目多的DNA。

实施例2

一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将侧链修饰有碱基鸟嘌呤的荧光共轭寡聚物OFBT-G溶于四氢呋喃溶液中，得到浓度为2×10^-3M的溶液A；Texas Red标记的8个碱基的寡核苷酸序列溶于超纯水中，得到浓度为2×10-8M的溶液B；

(2)将5μL溶液A迅速注入1mL溶液B中，混匀均匀，用聚四氟乙烯过滤膜过滤得到荧光复合纳米粒子的溶液C；

(3)将10μL浓度为1×10^-6M的扩增前后DNA分别加入到步骤(2)所述的溶液C中，作用30分钟；

(4)采用荧光光谱仪测试DNA加入前后溶液C的荧光强度，荧光共振能量转移效率高的待测样为扩增前的DNA，荧光共振能量转移效率低的待测样为扩增后的DNA。

实施例3

一种用于DNA检测的荧光复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将侧链修饰有碱基胸腺嘧啶的荧光共轭寡聚物OFBT-T溶于四氢呋喃溶液中，得到浓度为2×10^-3M的溶液A；Cy5.5标记的5个碱基的寡核苷酸序列溶于超纯水中，得到浓度为2×10^-8M的溶液B；

(2)将2μL溶液A迅速注入1mL溶液B中，混匀均匀，用聚四氟乙烯过滤膜过滤得到荧光复合纳米粒子的溶液C；

(3)将10μL浓度为1×10^-6M的酶切前后的DNA分别加入到步骤(2)所述的溶液C中，作用10分钟；

(4)采用荧光光谱仪测试DNA加入前后溶液C的荧光强度，荧光共振能量转移效率高的待测样为酶切后的DNA，荧光共振能量转移效率低的待测样为酶切前的DNA。

荧光复合纳米粒子由共沉淀作用制得，粒径均一，分散性好，对于不同碱基数目的DNA荧光信号变化特征明显，制得的荧光复合纳米粒子电镜图如图2所示；与现有技术相比，操作简单，制备时间短，并且检测的DNA无需荧光标记，成本低廉；采用侧基亲水性修饰的共轭寡聚物，水溶性较好；利用共轭寡聚物和寡核苷酸序列上标记染料之间的荧光共振能量转移效率变化检测DNA，荧光信号变化明显，检测灵敏度提高，检测结果如图3所示(Intensity为荧光强度，wavelength为波长)；所制备的荧光复合纳米粒子结构规整，具有独特的荧光性能及良好的生物兼容性，其在生物检测领域具有很好的实际应用价值。

本文虽然已经给出了本发明的几个实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。