60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0028] 步骤3,初筛：
[0029] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到10'10'10'KT6,取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培养 箱中继续倒置培养2-4d。
[0030]将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量0. 1 %的刚果红染液，染色l-10min，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0031] 步骤4,复筛：
[0032] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
[0033] 步骤5,菌种保藏：
[0034] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35-40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，lOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。
[0035] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0036] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓度 50mg/L〇
[0037] 富集培养基二：麸皮粉lg、玉米秸杆粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、无机盐营养液lmL，补 充水至100mL，pH4. 5，121°C、15min灭菌，自然冷却后，加入过滤除菌的氨苄青霉素至终浓 度 50mg/L。
[0038] 霉菌筛选培养基：PDA培养基800mL，孟加拉红0. 02g，氯霉素0. lg，无机盐营养液 lmL，补水至1000mL，琼脂粉15g。121°C、15min灭菌。孟加拉红和氯霉素灭菌后加入。
[0039] 阿魏酸酯酶初筛培养基：PDA培养基100mL，无机盐营养液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，琼脂粉1. 5g，pH4. 5,121°C灭菌20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，培养基逐渐 变得不透明，在60-70°C下倒入平板中。其中，阿魏酸乙酯溶液：称取0. 22g阿魏酸乙酯于离 心管中，加入500 y L N、N-二甲基酰胺溶液，震荡溶解后再加入500 y L无菌水，充分摇匀。
[0040] 纤维素酶初筛培养基：纤维素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，无机盐营养液lmL， 琼脂1. 5,加蒸馏水定容至100mL，pH值4. 5。121°C灭菌15min。
[0041] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉1. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0042] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0043] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温800. 5mL， (NH4)2S04lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0044] 上述培养基中，无机盐营养液：NaN03 2. 0g，K2P04 1. 5g，CaCl2 1. 5g，MgS04 0? 3g， FeS04 ? 7H20 0? lg，MnS04 ? H20 1. 6mg，ZnS04 ? H20 0? 05g，CoCl2 0? 5mg，（NH4)2S04 5g，去离 子水lOOOmL。
[0045] PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至lOOOmL。称取200g马铃薯，洗 净去皮切碎，加水l〇〇〇mL煮沸半个小时，纱布过滤，添加蔗糖20g，补充水至1000mL。
[0046] 表1产阿魏酸酯酶霉菌平板初筛结果
[0047]
【主权项】
1. 一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法， 其特征在于：包括以下步骤： 步骤1，发酵菌种的准备：将深绿木霉菌种AWS26在PDA活化培养基上划线活化，置于 37-40°C恒温培养箱中培养48-72h，得活化菌种； 步骤2,制备深绿木霉孢子悬液：从步骤1活化好的菌种中刮取深绿木霉菌丝，转移至 深绿木霉孢子培养基上，置于37-40°C生化培养箱内培养培养72h至菌丝长出孢子，经两 次传代培养恢复其活力，以含有〇. 01%吐温80的无菌水洗涤收集孢子，制备孢子含量为 I.OXIO8CFUAiL的孢子悬液； 步骤3,复合酶摇瓶液体发酵：将步骤2所得孢子悬液，以4-8v/v%接种量接入装有 100-150mL摇瓶发酵培养基一的三角瓶中，40-42°C摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/ min;然后将灭好菌的摇瓶发酵培养基二100-150mL倒入以上发酵18-24h后的三角瓶中，发 酵温度降至35-37°C，继续震荡发酵培养，发酵时间达到40-48h时，温度降至30-35h，继续 发酵24-48h，发酵终止，得混合酶发酵液； 步骤4,复合酶制剂的制备：取步骤3所得混合酶发酵液，过滤后将滤液8000r/min、 离心20min，取上清液，经超滤膜浓缩两次，浓缩液在50-60°C条件下真空浓缩，在所得粗酶 液中加入保护剂2-3wt%的糊精、l-3wt%的可溶性淀粉、0. 1-0. 2wt%的山梨酸钾，搅拌分散 后，-20°C冷冻8-10h，真空度30-40Pa、温度-35°C下，冷冻15-18h，即得复合酶制剂。
2. 根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素 酶复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤1中所述PDA活化培养基的配方为：土豆浸出液 100mL，无机盐液lmL，鹿糖 2g，琼脂粉I. 5g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌 15min。
3. 根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶 复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤2中所述深绿木霉孢子培养基的配方为：土豆浸出液 50mL，麸皮浸出液50mL，蔗糖lg，琼脂粉I. 5g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌15min;其中，土豆浸出 液：土豆削皮切成Icm3小块，称取200g，加入1000 mL水，煮沸30min，过滤，定容到1000 mL; 麸皮浸出液：50g麸皮加入300mL水，煮沸30min，过滤，定容到200mL。
4. 根据权利要求1所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶 复合酶制剂的方法，其特征在于：步骤3中所述摇瓶发酵培养基一的配方为：蛋白胨0. 5g、 葡萄糖 〇? 5g、硫酸铵 0? 5g、牛肉膏 0? 2-0. 5g、NaCl0? 5g、KH2PO4 0?lg、MgSO4IH2O0? 04g、 CaCl2 0? 2-0. 5g，去离子水 10OmT,,pH6. 5-6. 8,121°C灭菌灭菌 20min。
5. 根据权利要求I所述的深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶 复合酶制剂的方法，其特征在于：摇瓶发酵培养基二的配方为：麸皮粉2g、花生壳粉lg、米 糠粉lg、豆饼粉1-1. 5g、玉米浆lg、尿素0. 5g、NH4NO3 0. 5g、吐温80 2g，微量元素lmL，去 离子水100mL，pH6.5-6.8，121°C灭菌20min;其中，微量元素的配方为：MnCl2*4H20 0?lg， CoCl2 0? 05g，CuSO4 0? 02g，MgSO4 0? 3g，K2HPO4lg，FeS04.7H20 0?lg，ZnCl2 0? 03g，LiCl 0.05g，CaCl2 0.05g，H3BO3O.Olg，KI0.5g，去离子水 1000mL。
【专利摘要】本发明公开了一种深绿木霉三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂的方法，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的准备、孢子悬液的制备、摇瓶液体发酵、复合酶制剂的制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶与纤维素酶复合酶制剂，得到的复合酶制剂酶活力强、可溶于水、无异味、热稳定性好、催化活性强，具有极好的工业化应用前景。CGMCC No.867320140102
【IPC分类】C12R1-885, C12N9-18, C12N9-42
【公开号】CN104845952
【申请号】CN201510268501
【发明人】高兆建, 刘恩岐, 张建萍, 唐仕荣, 孙会刚, 徐大伟, 杨宪瑶
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月22日