RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合 蛋白及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 天然葡激酶（staphylokinase, SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性菌体合成的一种 胞外蛋白质，由136个氨基酸残基组成，分子量为15. 5KD。葡激酶与内生组织型纤溶酶原激 活剂（tissue plasminogen activator, tPA)、尿激酶（urokinase, UK)同为第三代溶栓制 剂，为临床心肌梗死溶栓治疗的一线用药，但其溶栓机制与其余两者不同：本身没有蛋白酶 活性，是一种"间接型"的纤溶酶原激活剂，通过与纤溶酶原（plasminogen，Fig)按1 :1的 比例特异性结合生成无活性的SAK-Flg复合物，在血栓表面痕量纤溶酶（plasmin，Flm)的 作用下进一步转化成有活性的SAK-Flm复合物，催化另一分子纤溶酶原形成纤溶酶，从而 激活纤溶系统。与tPA、UK相比，SAK具有更高的纤溶活性和纤维蛋白专一性，且不会引起 全身纤溶亢进，溶栓后出血并发症少。另外，SAK对陈旧性血栓和富含血小板的血栓溶解作 用突出，且对外周动静脉血栓均有良好溶栓效果。然而SAK作为一种葡萄球菌来源的异体 蛋白，免疫原性是限制其临床使用的主要原因之一，大部分患者用药后2周，机体会产生高 滴度的IgG中和抗体，且这些抗体水平至少可以维持7周，严重影响了 SAK的重复使用。同 时，大量研宄表明，使用葡激酶溶栓治疗血管开通后仍有一定的再梗塞率，这可能与活化后 血小板聚集反应所介导的动脉血栓再次形成有关，因此，通过抗血小板聚集来降低葡激酶 溶栓治疗后的再梗塞率将会是一种行之有效的策略。
[0003] 人a微球蛋白（a 1M)最早是从人尿中分离出来的一种糖蛋白，属于脂质运载蛋 白超家族，分子量为26KD。a 1M以单体或与IgA形成复合物的形式广泛分布于血浆与组织 外液中，参与免疫抑制反应，能抑制抗原诱导的人外周血淋巴细胞的重新分配，对机体内的 保护性免疫调节有着重要作用。
[0004] RGD序列即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD)序列，内源性RGD序 列存在于多种粘附蛋白中，发挥着多种生物学功能。含RGD序列的物质均可竞争性地抑制 Fig和GP II b/ III a受体的结合，而活化的GP II b/ III a受体只存在于血栓部位，可见RGD 序列有血栓靶向性，可以最直接、最完全地抑制活化血小板聚集，从而抑制血栓的形成。
[0005] 现有的一些RGD-重组葡激酶要么存在活性下降的问题，要么存在不溶性表达的 缺点。
[0006] 而且，现有技术中缺少在具有高效的溶栓抗凝活性同时，兼备低的免疫原性，低再 梗塞率，高溶栓靶向性的溶栓制剂。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种RGD-重组葡激酶-人a微 球蛋白融合蛋白及其制备与应用。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，不仅具有高 效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的 一些RGD-重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。
[0008] 本发明一方面提供了一种融合蛋白，为RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋 白。
[0009] 所述融合蛋白中，重组葡激酶（rSAK)的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，具体为： SFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEW ALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK。
[0010] 为提高葡激酶（SAK)的表达效率，本发明将野生型葡激酶基因进行了优化，在保 持蛋白质序列不变的情况下，优化部分可能影响翻译、表达过程的密码子碱基序列，使其成 为大肠杆菌的偏爱密码子或最佳密码子。同时，为了提高可溶性，将野生型SAK氨基端的18 个疏水残基（ELMLKRSLLFLTVLLLLF)截断。优化后的重组葡激酶（rSAK)全长基因序列如 SEQID NO. 1所示，具体为：
[0011] TCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGT GATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGA ACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACG TCGAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTT ACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGA TCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAo
[0012] 所述融合蛋白中，RGD的基因序列为CAG GGG CCC。
[0013] 所述融合蛋白中，R⑶和重组葡激酶之间可选择地含有连接肽三个残基（序列为 GSG) 〇
[0014] 较佳的，RGD连接于重组葡激酶的N端。
[0015] 所述融合蛋白中，人a微球蛋白（a 1M)的氨基酸序列包含165个氨基酸（其中 氨基端的29个疏水残基MRSLGALLLLLSACLAVSAGPVPTPTONI和羧基端的15个疏水残基 CVPGEQEPEPILIPR去掉。所述人a微球蛋白（alM)的氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，具 体为：
[0016] QVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSG AYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQG VGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。
[0017] 进一步的，所述人a微球蛋白（a 1M)连接于重组葡激酶的C端。
[0018] 本发明的融合蛋白，RGD和人a微球蛋白（a 1M)直接分别连接于重组葡激酶 (rSAK)的N短和C端，对重组葡激酶（rSAK)本身氨基酸结构的改变很小，很好地保持了重 组葡激酶的溶栓活性。同时，有利于融合蛋白的细胞内折叠，实现可溶性表达，具有很好的 抗凝活性。
[0019] 进一步的，所述RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 12所示，具体为：
[0020] RGDSSFSSITNEVSASSSFDKGKYKK⑶DASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPG TTLTKEKIEYYVEffALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNL ITKVVIEKKGSGQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCE ETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRV VAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEo
[0021] 本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。
[0022] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0023] 编码所述融合蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的 技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等， 科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；优选采用重叠延伸PCR 法。
[0024] 在本案的较佳实施例中，所述融合蛋白，其核苷酸编码序列如SEQID NO. 9所示， 具体为：CGAGGGGAITCGTCAITCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGITTCGATAAAGGCAAAT ACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGC AAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAAT CGAATATTACGTC GAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCT AAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTT CGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAG GGTCGGGGCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCAC CTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGG AGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACT GATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGA GTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGC CGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTC ACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAAo
[0025] 其对应的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 12所示，具体为：
[0026] RGDSSFSSITNEVSASSSFDKGKYKK⑶DASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKP