一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明设及抗体及其制备技术领域，具体设及一种特异性针对人N0TCH1 NICD蛋 白Ser2162位点憐酸化抗体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] NOTCH信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和 脊椎动物的多个物种之中，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控 了多细胞机体的细胞调亡、增殖和分化。从果蛹到人类，NOTCH信号途径的遗传特征高度保 守，而在哺乳动物中其过程尤为复杂。
[0003] NOTCH受体、NOTCH配体和细胞内效应分子C化共同组成NOTCH信号通路。NOTCH受体 为单链跨膜蛋白，其分子由胞外区化CN)、跨膜区和胞内区(NICD)组成，具有高度保守性(参 见图1)。目前哺乳动物中发现4种NOTCH基因（N0TCH1，N0TCH 2，N0TCH 3，N0TCH 4)，各亚型 的主要差异在EGF样重复的数目和胞内区的长度。NOTCH配体亦为细胞表面表达的单链跨膜 蛋白，已发现人的NOTCH配体有Jagged 1 Jagged 2，Del1:a l，Del1:a 3，Del1:a 4。
[0004] NOTCH信号蛋白受体与配体相互作用导致NOTCH蛋白连续裂解，释放出胞内段蛋白 (NICD)，N0T〇n NICD转入细胞核内，通过与CBFl/Su化)/LAGl(CSL)相互作用形成复合物， 使后者由转录抑制因子转化为转录激活因子。NICD-CBFl/Su化)/LAGl(C化)复合物直接诱 导转录的祀基因是皿S1，皿S1是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)类转 录因子，它又调节其它与细胞分化直接相关基因的转录。在细胞分化中，NOTCH信号的功能 有W下几个方面:①参与胚胎发育;②参与T细胞发育;③维持造血干细胞的自我更新;④调 节血管生成。
[0005] N0TCH1信号途径参与细胞的分化、增值和调亡，并影响许多器官的发育和功能，其 病理生理改变与肿瘤、血液系统、屯、血管系统、干细胞等多种疾病相关。研究表明：在肿瘤的 发生和发展过程中，N0TCH1信号通路发挥着不同的作用;在大多数恶性肿瘤中，N0TCH1信号 主要为促癌作用，活化的N0TCH1蛋白可使细胞恶性转化发展为肿瘤，如在宫颈癌、头颈肿 瘤、肾癌及多种血液系统肿瘤中均发现N0TCH1的异常表达;N0TCH1信号的素乱会阻止细胞 分化，使得未分化细胞向恶性转化;而在B细胞白血病等肿瘤中，N0TCH1则可W抑制细胞生 长诱导调亡。在宫颈癌的早期，N0TCH1信号起促癌作用，晚期则起抑癌作用。运表明N0TCH1 在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段中，其发挥的作用也不尽相同。此外，由于N0TCH1信号通路可 能作为多条通路的重要交汇点，N0TCH1信号的异常不仅对肿瘤的发生有直接的作用，而且 能通过对其他通路的影响间接地诱导肿瘤的发生。
[0006] 憐酸化、泛素化等翻译后修饰在NOTCH信号通路介导的生理和病理过程中发挥着 关键作用。细胞中N0TCH1 NICD蛋白的降解对于N0TCH1信号通路的精准调控具有非常重要 的意义，其半衰期主要由泛素化修饰和蛋白酶体介导的降解进行调节。已有研究表明： NOTCH蛋白泛素化修饰的前提条件是N0TCH1 NICD蛋白必须进行憐酸化修饰。若N0TCH1 NICD蛋白憐酸化修饰发生异常，将造成半衰期的延长而导致白血病和其它癌症的发生。因 此，N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修饰在N0TCH1信号通路的调控中扮演着重要角色。此外，已 有证据表明：N0TCH1蛋白的憐酸化修饰可依赖于GSK-3的敦酶，而GSK-3的敦酶在Wnt-1信号通 路中亦发挥重要的生物学功能，因此NOTCH信号通路与Wnt-1信号通路存在交叉反应。 N0TCH1蛋白的持续活化对Wnt-1信号通路将产生一定的影响，从而导致细胞的致癌性转化。 ΝΟΤΟΠ 氨基酸序列中Ser2162位点位于NOTCH的胞内段序列区，是ΝΟΤΟΠ NICD蛋白憐酸化 修饰的一个位点，在N0TCH1 NICD蛋白降解失活的动态调控中可能具有重要的作用。
[0007] 抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床 应用中，憐酸化抗体的制备和应用已成为国际上关注的热点。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于解决在N0TCH1信号通路中发挥重要作用的NICD蛋白憐酸化修饰 有效研究的问题，N0TCH1 NICD蛋白发挥作用的首要条件是进行翻译后修饰作用，如憐酸化 修饰。为此本发明提供一种特异性针对人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体的制备 方法。
[0009] 本发明提供的人N0TCH1 NI CD蛋白Ser 2162位点憐酸化抗体的制备方法可W包括 W下步骤：（1)合成包含如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的抗原合成肤；（2)利用步骤（1) 合成的抗原合成肤免疫动物并收集抗血清；（3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定， 得到人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体。
[0010] 上述步骤（1)中所述的抗原合成肤可W通过W下步骤合成：W人N0TCH1 NICD蛋白 Ser2162位点为中屯、两侧各邮邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的合成肤， 并采用多肤合成技术进行合成，在氨基酸Ser2162上添加憐酸化基团，同时在N末端连接一 个半脫氨酸与载体蛋白血蓝蛋白化LH)或牛血清白蛋白（BSA)进行偶联。
[0011] 上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可W包括：用上述步骤（1)合成的抗原合成 肤与佐剂联合免疫新西兰大白兔;免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下 注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射； 免疫次数包括1次引发注射，3~4次加强注射和最后一次抗原直接注射。
[0012] 上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可W包括:将上述步骤(2)收集的抗血清 WELISA实验测定抗血清针对目的合成肤的效价及其是否能够特异性识别目的合成肤，利 用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，WDot blot和Western blot实验确定 抗血清是否能够特异性识别憐酸化N0TCH1 NICD蛋白。
[0013] 上述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤可W包括:采用 合成肤偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化;首次采用非憐酸化 合成肤偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非憐酸化抗体，得到含 憐酸化抗体流出液;接着使用憐酸化合成肤偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化， 除去憐酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。
[0014] 本发明还提供一种通过上述方法所制备的人ΝΟΤΟΠ NICD蛋白Ser2162位点憐酸 化抗体。
[0015] 本发明还提供上述人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体在制备用于肿瘤、 血液系统、屯、血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。
[0016] 本发明还提供一种用于肿瘤、血液系统、屯、血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定 的药物制剂，其包括上述的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体。
[0017] 本发明还提供一种合成肤在制备用于肿瘤、血液系统、屯、血管系统疾病的诊断、治 疗及预后判定的药物制剂中的应用，所述合成肤包含如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
[0018] 上述药物制剂包括上述的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体。
[0019] 本发明制备得到的高特异性的人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化抗体可用 Western blot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究 N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊 断或治疗提供潜在的作用祀点，还可W用ICC、化ISA等免疫学相关实验W检测人N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、屯、血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、 治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。
[0020] 本发明的优点及实现的有益效果：（1)本发明提供憐酸化抗体在实际应用中能够 检测人ΝΟΤΟΠ NICD蛋白的翻译后憐酸化修饰情况；（2)本发明提供的憐酸化抗体在实际应 用中便于探讨人N0TCH1 NICD蛋白特定位点憐酸化修饰与特定生物学事件如细胞应激、DNA 损失、细胞周期等的相关性；（3)本发明是针对人N0TCH1 NICD蛋白Ser2162位点憐酸化多克 隆抗体，有助于研究介导其发生憐酸化的激酶作用，探讨人N0TCH1 NICD蛋白多种生物学功 能在N0TCH1细胞信号通路及蛋白/核酸相互作用网络；（4)本发明提供的憐酸化抗体有助于 探讨N0TCH1 NICD蛋白的憐酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于检 测用药后肿瘤相关蛋白表达的差异，为临床肿瘤疾病的诊断与治疗提供潜在的作用祀点。
【附图说明】
[0021] 图1是N0TCH1蛋白结构图。
[0022] 图2是根据本发明实施例的的制备与纯化高特异性的人N0TCH1 NICD憐酸化抗体 技术路线图。
[0023] 图3是N0TCHl_Human PhosohoSitePlus查询结果屏幕截图，其中，SS:蛋白质组学 检测文献;MS:质谱检测文献。
[0024] 图4是N0TCH1 NICD抗原性分析结果。
[00巧]图5是N0TCH1 NICD疏水性性分析结果。
[00%] 图6a是合成肤pSer2162-KLH的HPLC纯化结果。
[0027] 图化是合成肤pSer2162-KLH的Mass Spectral检测结果。
[0028] 图7a是合成肤pSer2162-BSA的HPLC纯化结果。
[00巧]图7b是合成肤pSer2162-BSA的Mass Spectral检测结果。
[0030] 图8a是合成肤Ser2162-BSA的HPLC纯化结果。
[0031] 图8b是合成肤Ser2162-BSA的Mass Spectral检测结果。
[0032] 图9是S2162-BSA、pS2162-BSA蛋白电泳图，其中，l:S2162-BSA;2:pS2162-BSA;M: Marker(Bro曰d)C
[0033] 图10是免疫前筛选Western blot结果图，其中，1:BSA标准蛋白（5yg);2:S2162- BSA合成肤(5yg) ;3:pS2162-BSA合成肤(5yg); -抗：阴性血清1:5000稀释液。
[0034] 图 11 是PS2162-KLH蛋白电泳图，其中，M:Marker(Broad); 1 :pS2162-KLH。
[0035] 图12是非憐酸化层析柱和憐酸化层析柱的偶联效率检测