用于植物表达重组人血白蛋白基因的转基因农杆菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于在植物中表达重组人血白蛋白基因的农杆菌菌株。它解决了目前重组人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产的问题。重组人血白蛋白转基因工程菌株为含有重组人血白蛋白基因质粒的农杆菌，表达出的蛋白质为人血白蛋白，菌株中所含有的重组人血白蛋白基因序列为在启动密码子前插入了Kozak序列的人血白蛋白开放阅读框碱基“基本序列”，或在此基础上在N端起始密码子后插入编码6个重复组氨酸的序列（6xHis），6xHis与白蛋白序列之间由编码肠激酶底物的序列连接的“改进序列”。本发明重组人血白蛋白转基因工程菌株可用于利用转基因植物规模化生产基因重组人血白蛋白。
【专利说明】用于植物表达重组人血白蛋白基因的转基因农杆菌株
[0001 ] 技术邻域 本发明涉及一种用于在植物中表达重组人血白蛋白基因的农杆菌菌株，用于利用植物 表达和制备重组人血白蛋白。农杆菌中的转化质粒包含白蛋白基本序列或在N末端连有组 蛋白标签和肠激酶底物序列的改进序列。
【背景技术】
[0002] 人血白蛋白（human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化 的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆 总蛋白的60%左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于 组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体(preproHSA)在肝脏中合成，并且在高尔基 体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要 作用;它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性 物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛 用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。
[0003] 目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来 源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身 也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人 血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不 同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，但利用微生物和动物为反应器生产重组人血 白蛋白等方法因表达后期的加工水平差异及表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业 化生产。所以，人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决目前人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行 产业化生产的问题，提供两种重组人血白蛋白基因序列及其转基因工程菌株。
[0005] 重组人血白蛋白转基因工程菌为含有重组人血白蛋白基因质粒的农杆菌，其中质 粒中重组人血白蛋白基因如"基本序列"或"改进序列"所示。
[0006] 本发明重组人血白蛋白转基因工程菌株为革兰式阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为 0.6-1.0 μπι、菌长为1.5-3.0 μπι，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为28°C，最适酸碱度 为pH6.0;菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素 抗性。
[0007] 本发明重组人血白蛋白转基因序列中，为了增强目的基因的表达效果，重组人血 白蛋白基因前设计了一个Kozak序列；为了在表达后便于纯化目的蛋白，在其中一种重组人 血白蛋白基因序列如设^1个6 X Hi s标签。
[0008] 本发明重组人血白蛋白转基因工程菌株可用于介导植物。用转基因工程菌株介导 植物，以植物为反应器进行大规模、产业化生产具有以下优点：（1)植物与动物同为真核生 物，具有比较高级的真核蛋白合成途径，从而能够成功的进行转录后的修饰与加工，克服了 微生物反应器不能完整的表达功能性蛋白的缺陷；（2)外源蛋白在植物中可以积累到较高 水平，并且植物中表达的蛋白在功能上与动物自身生产的蛋白相同，可见转基因植物具有 作为生物反应器生产蛋白、疫苗、抗体、细胞因子的能力；（3)植物病原菌不会对人或动物构 成威胁，所以避免了动物表达系统的产品有被病原菌污染的可能，所以以植物作为生物反 应器生产人血白蛋白更为安全;④以植物作为生物反应器易于规模化生产，与其它生物反 应器相比较，植物的种植更加低廉。植物可以大规模种植和收获，表达的产物可以贮藏在根 茎、种子、叶子或果实中便于贮藏和运输。筛选得到的纯系转基因植株，目的基因可以稳定 遗传，大大降低了生产成本。
【附图说明】
[0009]图1.重组人血白蛋白转基因工程菌(表达"基本序列"）菌落PCR产物琼脂糖凝胶电 泳结果。M为分子标记(5000 bp)，泳道1为阳性对照，泳道2-9为8个单菌落作模板的PCR产物 (1785 bp)，C为空白对照。
[0010]图2.重组人血白蛋白转基因工程菌(表达"改进序列"）菌落PCR产物琼脂糖凝胶电 泳结果。M为分子标记(5000 bp)，泳道1-8为8个单菌落作模板的PCR产物（1824 bp)，泳道9 为阳性对照，C为空白对照。
[0011] 图3.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第294位至第1位核苷酸 酸的反向测序结果图。
[0012] 图4.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第594位至第295位核苷 酸的反向测序结果图。
[0013]图5.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第595位至第894位核苷 酸的正向测序结果图。
[0014] 图6.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第895位至第1194位核 苷酸的正向测序结果图。
[0015] 图7.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第1195位至第1494位核 苷酸的正向测序结果图。
[0016] 图8.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "基本序列"第1495位至第1767位核 苷酸的正向测序结果图。
[0017] 图9.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "改进序列"第338位至第1位核苷酸 的反向测序结果图。
[0018] 图10.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "改进序列"第638位至第339位核 苷酸的反向测序结果图。
[0019] 图11.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA"改进序列"第639位至第938位核 苷酸的正向测序结果图。
[0020] 图12.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "改进序列"第939位至第1238位核 苷酸的正向测序结果图。
[0021] 图13.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA"改进序列"第1239位至第1538位 核苷酸的正向测序结果图。
[0022] 图14.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA "改进序列"第1539位至第1800位 核苷酸的正向测序结果图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明技术方案不局限于以下所列举的【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间 的任意组合。
[0024]
【具体实施方式】一:本实施方式重组人血白蛋白转基因"基本序列"如下： GCCACCATGGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCTT TGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACT GAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAA ATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAA ATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGC ACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTA TGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTG CCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCC AGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGA GTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAAT GTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGC TGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTC ATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGT TTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACC ACTCTAGGGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGT GGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAA GTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAA CCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACA GGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTC CATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACA CAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGG CTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA TAATAA 本实施方式重组人血白蛋白基因序列根据植物双元表达载体的选择作相应的密码子 突变;为了增强目的基因的表达效果，重组人血白蛋白基因前设计了一个Kozak序列（基因 序列下划线部分）。
[0025]本实施方式在启动子CaM V35S后添加起始密码子(ATG)，用于起始氨基酸编码。本 实施方式在重组人血白蛋白C端末尾设计了三个终止密码子(TAA)，用于终止氨基酸编码； 在完整基因序列前后各设计了一个Xbal和Xmal：酶切位点，用于后续基因操作。
[0026] 本实施方式基因序列用于插入pBI121载体上的gus基因上游，缩短了重组人血白 蛋白与CaMV 35S启动子之间的距离，同时加入了双酶切效率高的限制性内切酶(XbaI和XmaI: )来提高酶切和连接效率;而且在限制性内切酶两侧添加了保护性碱基，对限制性内切酶进 行保护。
[0027]【具体实施方式】二:本实施方式重组人血白蛋白转基因"改进序列"如下： GCCACCATGCATCATCACCATCACCATGATGACGACGATAAGGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGT TTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCTTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTT GAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTG TGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGG CTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCC CGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTT ATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTT TTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAG GCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGT AGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCC ACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAAT CAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGT GGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACT ATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTG CTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTA TGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTG AGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCA ACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCC CTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAG TCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTT CCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAA GAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATG ATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTT GTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAATAATAA 本实施方式选用植物表达系统表达重组人血白蛋白，为了便于目的蛋白表达后的纯 化，在重组人血白蛋白N端设计一个6 XHis标签(基因序列双线部分）。此外为了使6 XHis与 目的蛋白分离，在6XHis与目的蛋白之间设计一个胰蛋白酶酶切位点（Asp Asp Asp Asp Lys，基因序列中曲线部分），可利用胰蛋白酶将6XHis与目的蛋白分离。其它与具体实施方 式一相同。
[0028]【具体实施方式】三:本实施方式重组人血白蛋白转基因工程菌株为含有人血白蛋白 基因质粒的农杆菌，其中质粒中的人血白蛋白基因序列为"基本序列"或"改进序列"。
[0029] 本实施方式重组人血白蛋白转基因工程菌为革兰式阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽 为0 · 6-1 · 0 μπι、菌长为1 · 5-3 · 0 μπι，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为28°C，最适酸碱 度为PH 6.0;菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那 霉素抗性。
[0030] 本实施方式将人血白蛋白基因序列克隆到PGEM-T载体上，通过PCR扩增基因序列 得到"基本序列"和"改进序列"，并进行XbaI和XmaI双酶切，回收酶切产物，并用T4 DNA连接 酶或In-Fusion试剂盒将重组人血白蛋白基因克隆到ρΒΙ121植物表达载体上，经测序可知 重组人血白蛋白基因成功克隆到PBI121植物表达载体上，"基本序列"和"改进序列"分别成 功插入CaMV 35S启动子与gus基因之间。用电转化法导入根癌农杆菌GV3101中，从而得到重 组人血白蛋白转基因工程菌株。
[0031]本实施方式使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易够得，若无特殊要 求则浓度为标注浓度。
[0032]本实施方式重组人血白蛋白基因（含His标签)与6 XHis标签序列相连接，这段His 标签可以与纯化柱子上的配基特异性的结合，这样所表达的融合蛋白可以快速简便的纯化 出来，所得到的融合蛋白经酶法切割后进一步纯化，能得到较高纯度的重组人血白蛋白。
[0033] 【具体实施方式】四：本实施方式对重组人血白蛋白转基因工程菌株进行鉴定，鉴定 方法为PCR检测及PCR产物测序。具体步骤如下： 将电转化法转化得到的菌体涂布于含50mg/L Kan、50mg/L Rif的LB固体培养基中，28 °C倒置培养48h;再以抗性平板上长出的单菌落为模板，分别以P1/P2，P3/P4为引物进行PCR 扩增，设置阳性对照为含有目的基因片段的质粒，空白对照为ddH20,反应体系分别如下：
【m】"基本序列"的正向引物为5 '-GCGTCTAGAGCCACCATGGATGCACACAAG-3 ' ； "改进序列" 的正向引物为5 ' -AGAGTCGACGCCACCATGCATCATCACCAT-3 '。
[0034] 【注2】"基本序列"的反向引物为5，-TCCCCCGGGTTATTATTATAAGCCTAA-3，； "改进序列" 的反向引物为5 ' -CCACCCGGGTTATTATTATAAGCCTAAGGC-3 '. PCR反应条件：预变性95°C，5min，变性95°C，10sec，退火55°C，30sec，延伸72°C，2min， 共30个循环，延伸72°C，10min，4°C保存。
[0035] 本实施方式PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1和图2所示;表达"基本 序列"的菌落DNA测序结果如图3、图4、图5、图6、图7及图8所示，表达"改进序列的"菌落DNA 测序结果如图9、图10、图11、图12、图13及图14所示。测序结果所对应的氨基酸序列如序列 表中序列7与序列8所示，根据分析其与人血白蛋白氨基酸序列匹配率达100%。
【主权项】
1. 转基因农杆菌菌株，含有表达人血白蛋白的外源质粒，表达出的人血白蛋白氨基酸 序列如序列表所示。2. 重组人血白蛋白转基因 DNA序列，其特征在于重组人血白蛋白转基因"基本序列"或 在基本序列基础上在白蛋白N末端加上了组蛋白标签及肠激酶底物序列的"改进序列"；"基 本序列"或"改进序列"如序列表所示。3. 重组人血白蛋白转基因工程菌株，其特征在于重组人血白蛋白转基因工程菌株为含 有重组人血白蛋白基因质粒的农杆菌，其中质粒中所包含的重组人血白蛋白基因如基本序 列及改进序列所示。4. 根据权利要求3所述的重组人血白蛋白转基因工程菌株，其特征在于重组人血白蛋 白转基因工程菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为0.6-1. Ομπι、菌长为1.5-3. Ομπι， 好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为28°C，最适酸碱度为ρΗ6.0;菌落通常为圆形、隆起、 光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素抗性。
【文档编号】C12N15/14GK105861406SQ201610306847
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】王大勇, 陈林涛, 韦双双
【申请人】王大勇