专利名称：一种重组蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蛋白质，具体地说是涉及一种严重急性呼吸窘迫综合症(SARS)病毒的重组蛋白质，及其在制备SARS疫苗和制备预防、治疗SARS药物中的用途。
背景技术：
严重急性呼吸窘迫综合症(以下简称SARS)是一种新发现的急性传染病。截止目前为止，全球已经有8450人染病，810人死亡。现在已发现，引起SARS的病原体是一种新发现的冠状病毒，该病毒被命名为SARS病毒。
在这次SARS流行以前，人们发现可以感染人类的冠状病毒只有HCV-229E和HCV-OC43两种，15-30％的人类感冒是由这两种冠状病毒引起的。通过基因同源性比较，人们发现SARS病毒与HCV-229e及HCV-OC43的同源性均为30％左右。
实验证明，冠状病毒一般为单链正链RNA病毒，其编码的S蛋白(spike蛋白)可以与相应的受体结合，从而介导病毒进入宿主细胞。不同的冠状病毒编码的S蛋白不同，因此可以识别特定物种细胞的相应受体，继而选择性的感染特定物种的细胞，是所有冠状病毒的特点。病毒的基因组必须在宿主细胞内被S蛋白等病毒编码蛋白包装后，才能形成完整的具有感染性的病毒颗粒。在SARS病毒的包装过程中，其编码的S蛋白可以存在于宿主细胞的细胞质中。
已知感染病毒以后，人体内的免疫系统可以产生针对病毒各种成分的免疫应答，包括体液免疫应答与细胞免疫应答，一般认为，其中能识别病毒表面与宿主细胞受体结合分子的特异性抗体，可以阻断病毒感染宿主细胞，因此这类抗体也称为保护性抗体，是判断机体抵抗病毒感染能力和评价疫苗保护作用的重要指标，如抗乙型肝炎表面抗原的抗体。对冠状病毒感染的研究表明，针对冠状病毒S蛋白上受体识别片段的性抗体可以特异性地阻断病毒感染宿主细胞，是一种主要的保护性抗体。目前还没有针对冠状病毒感染的特效药物，保护性抗体的产生是患者冠状病毒感染后的痊愈的主要机制，因此，保护性抗体也是判断病情转归的重要指标。由于冠状病毒的S蛋白上受体识别序列的差异，针对各种冠状病毒S蛋白的保护性抗体具有很高的特异性，针对一种冠状病毒的保护性抗体只能保护人体不受同种病毒的感染而不能保护人体避免其它冠状病毒的感染。
重组蛋白质疫苗是一种既可以用于预防病毒感染性疾病的人工疫苗，可以避免病毒复活或病毒毒力恢复等灭活和减毒疫苗的缺陷。此外，重组S蛋白片段本身由于与SARS病毒上受体识别序列具有相似的结构，因此，可以在体内竞争性地抑制SARS病毒识别病毒受体，感染宿主细胞，可以用来制备治疗SARS的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供用于SARS诊断、治疗和预防的重组蛋白质。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供一种重组蛋白质，具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列，其为SARS病毒S蛋白345～655位的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加，且具有与(a)中蛋白质相同功能的蛋白质。
本发明提供一种上述重组蛋白质作为SARS病毒抗原的用途。
本发明提供一种上述重组蛋白质在制备SARS疫苗中的用途。
本发明提供一种上述重组蛋白质在制备治疗SARS药物中的用途。
本发明提供一种上述重组蛋白质肽在制备诊断SARS试剂中的用途。
本发明提供的重组蛋白质可通过常规的重组蛋白表达技术制备。
本发明提供的重组蛋白质的优益之处在于本发明首次在体外表达了重组SARS病毒S蛋白的受体识别功能片段；同时，通过化学结构计算证实该片段是SARS病毒识别受体的主要功能区域；并在检测的SARS康复患者的血清中，均发现了能识别这个重组蛋白质的抗体；在机体感染SARS病毒时，可以通过自身产生或外源输入的这种重组蛋白质抗体，阻断SARS病毒感染正常细胞，而达到治疗或者预防SARS病毒感染的作用；同时，也可以通过对能针对该重组蛋白抗体的检测，对SARS病毒感染的发生、发展以及是否能好转进行诊断。此外，该重组蛋白片段本身还能直接竞争性的抑制SARS病毒与其病毒受体的结合，而达到治疗或者预防SARS病毒感染的作用。
图1是实施例2的重组蛋白质与SARS康复者和对照组正常人血清的western blot分析图，其中图1-1和图1-2分别代表重组蛋白质与康复者和正常人血清的反应图象，在图1-1中可以明显地看到重组蛋白质被SARS康复者血清识别的条带；“→”指向处为实施例2的重组蛋白质；图2是实施例5的重组蛋白质与SARS康复者和对照组正常人血清的western blot分析图，其中图2-1和图2-2分别代表重组蛋白质与康复者和正常人血清的反应图象，在图2-1中可以明显地看到重组蛋白质被SARS康复者血清识别的条带；“→”指向处为实施例5的重组蛋白质。
具体实施例方式
实施例1、含有SARS病毒S蛋白345～655位的氨基酸序列的谷胱甘肽(GST)融合蛋白的表达和纯化利用香港科技大学生物系提供的含有编码SARS病毒S蛋白序列的重组质粒为模板，采用如下SARS病毒S蛋白受体识别功能片段的特异性引物，sense GGGGATCCTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCanti-sense CCGGTACCTGTATGGTAACTAGCACAAATGCCAGC，通过PCR(PCR的条件为94℃ 5分钟；94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃2分钟，共25个循环；然后，72℃延伸6分钟)扩增得到编码的目的片段。利用上述引物中分别包含的BanHI的酶切位点和KpnI的酶切位点(图中划横线处)，将PCR得到的片段和PGEX-4T-2(购自Amersham Pharmacia公司)分别用限制性内切酶BamHI和KpnI酶(均购自Promega公司)切，再经过电泳、胶回收，并经DNA片段纯化制剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司)纯化，连接转化DH5α感受态细菌。挑取单个菌落，用BamHI和KpnI酶切鉴定。将鉴定后的DH5α细菌，接种在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，培养24小时后挑取单个菌落接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养，并用0.2mM的IPTG进行诱导(30℃，诱导4小时)。收获菌液，离心(10000rpm，20分钟)，收获细菌，超声裂解细菌，12000g离心10分钟，分别收集菌体和上清，电泳鉴定。结果表明，目的蛋白出现在包涵体内。将包涵体分别用洗涤液Buffer B(100Mm NaH2PO4，130Mm NaCl；TritonX-100(0.5-1％))及Buffer A(130Mm NaCl，100mm NaH2PO4)洗涤包涵体，将包涵体用裂解液(0.3％ N-laurysarcosine)溶解15分钟后，离心(12000rpm，10分钟)，去沉淀，透析复性(20mM Tris-Cl pH8.0)48小时。然后，将复性液用亲合层析法，使用Pharmacia公司的Bulk GST纯化试剂盒纯化得到含有目的片段的GST融合蛋白。
实施例2、具有序列1所示的氨基酸序列的重组蛋白质的制备和纯化将实施例1得到的GST融合蛋白中的凝血酶切割位点(LeuValProArg↓GlySer)，对该融合蛋白进行切割，以获得具有序列1所示的氨基酸序列的重组蛋白质。将GST融合蛋白用还原性谷胱甘肽缓冲液(10mM的还原性谷胱甘肽溶于50mM Tris-HCL pH8.0)溶解至浓度为1mg/ml，取1ml融合蛋白溶液加入14毫升1×切割缓冲液(20mMTris-HCL pH8.4，150mM NaCL和2.5mM CaCL2)和1单位凝血酶(Novagen产品Thrombin Protease，restriction grade)，在室温下孵育4小时。然后，将蛋白溶液经Pharmacia公司的GST亲和层析柱纯化，收集有具有序列1所示的氨基酸序列的重组蛋白质的流出液，蔗糖透析浓缩至1.5毫升。
实施例3、重组蛋白质与病毒受体结合力的计算本发明采用化学结构计算软件(Autodock 2.0)对SARS病毒在人类细胞表面的受体(人血管紧张素转化酶II，文献Wenhui Li，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 is afunctional receptor for the SARS coronavirus.Nature.2003，426450-454)和SARS病毒S蛋白进行结构稳定性计算分析。结果表明，包含具有序列1所示的氨基酸序列的重组蛋白质的蛋白片段与血管紧张素转化酶II形成的结构较稳定，证实该序列为SARS病毒识别受体的必要片段。
实施例4、用western blot的方法来分析SARS康复者血清中识别具有序列1所示的氨基酸序列的重组蛋白质的抗体。
本发明中采用的SARS康复者血清(北京大学第一医院检验科采集)来自SARS痊愈1个月的经临床诊断和ELISA确诊为SARS的患者，在患病期间，患者有发热、干咳和胸部X光检查改变等症状和体征。对照组正常人血清为SARS流行前本室收集的健康人血清。将实施例2得到的纯化的重组蛋白质，在10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到硝酸纤维膜上；将膜用3％的BSA封闭1小时后，分别与SARS康复者的血清和正常人血清(均为1∶500)孵育1小时，然后将血清洗去，加入HRP标记的羊抗人IgG和IgM抗体，孵育1小时；将抗体洗去，用Promega公司的NBT/BCIP显色系统显色，观察条带，结果如图1所示。其中图1-1和图1-2分别代表重组蛋白与康复者和正常人血清的反应图象。在图1-1中可以明显地看到重组蛋白被SARS康复者血清识别的条带，而图1-2中则未见特异性的反应条带。这表明本发明的重组蛋白质只能被SARS康复者血清中的特异性抗体所识别，是针对SARS康复的标志。
实施例5、含有SARS病毒S蛋白1～655位的氨基酸序列的重组蛋白质的制备和纯化利用香港科技大学生物系提供的含有编码SARS病毒S蛋白序列(编码SARS病毒S蛋白N端655个氨基酸残基的蛋白质)的重组质粒为模板，采用如下SARS病毒S蛋白受体识别功能片段的特异性引物，SenseGGGGATCCAGTGACCTTGACCGGTGCACCACAntisenseCCGAATTCAACTGTATGGTAACTAGCACAAATGCC通过PCR(PCR的条件为94℃ 5分钟；94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 2分钟，共25个循环；然后，72℃延伸6分钟)扩增得到编码的目的片段。利用上述引物中分别包含的BamHI的酶切位点和EcoRI的酶切位点(图中划横线处)，将PCR得到的片段和pET32a-TRX(购自Amersham Pharmacia公司)分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶(均购自Promega公司)切，再经过电泳、胶回收，并经DNA片段纯化制剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司)纯化，连接转化BL21(Rare Codon)感受态细菌。挑取单个菌落，用BamHI和EcoRI酶切鉴定。将鉴定后的BL21(Rare Codon)细菌，接种在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，培养24小时后挑取单个菌落接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养，并用0.2mM的IPTG进行诱导(30℃，诱导4小时)。收获菌液，离心(10000rpm，20分钟)，收获细菌，超声裂解细菌，12000g离心10分钟，分别收集菌体和上清，电泳鉴定。结果表明，目的蛋白出现在包涵体内。将包涵体重悬于20ml Buffer A(6M盐酸胍，10mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaH2PO4)，室温磁力搅拌2小时，过滤，将上清液与Qiagen公司的Ni-NTA柱平衡，然后分别用5倍体积的Buffer B(8M尿素，10mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaH2PO4)；10倍体积的Buffer C(同B，pH6.3)；2倍体积的Buffer D(同B，pH5.9)，最后用2倍体积的Buffer E(同B，pH4.5)对目的蛋白进行特异性洗脱，分步收集，得到纯化的具有SARS病毒S蛋白N端1～655位的氨基酸序列的重组蛋白质。
实施例6、用western blot的方法来分析SARS康复者血清中识别实施例5中所制备的重组蛋白质的抗体。
本发明中采用的SARS康复者血清(北京大学第一医院检验科采集)来自SARS痊愈1个月的经临床诊断和ELISA确诊为SARS的患者，在患病期间，患者有发热、干咳和胸部X光检查改变等症状和体征。对照组正常人血清为SARS流行前本室收集的健康人血清。将实施例5得到的纯化的重组蛋白质，在10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到硝酸纤维膜上；将膜用3％的BSA封闭1小时后，分别与SARS康复者的血清和正常人血清(均为1∶500)孵育1小时，然后将血清洗去，加入HRP标记的羊抗人IgG和IgM抗体，孵育1小时；将抗体洗去，用Promega公司的NBT/BCIP显色系统显色，观察条带，结果如图2所示。其中图2-1和图2-2分别代表重组蛋白与康复者和正常人血清的反应图象。在图2-1中可以明显地看到重组蛋白被SARS康复者血清识别的条带，而图2-2中则未见特异性的反应条带。这表明本发明的重组蛋白质只能被SARS康复者血清中的特异性抗体所识别，是针对SARS康复的标志。
本发明提供的重组蛋白质可用于SARS病毒抗原，也可用于制备SARS疫苗，或是制备治疗SARS药物及制备诊断SARS的试剂。所述的重组蛋白质不仅仅局限于含有序列1所示的氨基酸序列的蛋白质，将此氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加，也具有相同功能。
序列表序列号1名称重组蛋白质序列长度311序列类型氨基酸拓扑学线性序列种类肽来源生物名SARS病毒组织种类S蛋白序列特征
特征的记号肽存在位置1..311序列Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr LysLeu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val IleAla Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val LeuAla Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr AsnTyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu ArgAsp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr ProPro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr ThrThr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser PheGlu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser ThrAsp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu ThrGly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe GlnGln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp ProLys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ala Phe Gly Gly ValSer Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val LeuTyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala AspGln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val PheGln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr SerTyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr HisThr Val Ser Leu Leu Arg Ser
FPI03172-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110> 北京大学<120> 一种重组蛋白质<130> FPI03172<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 311<212> PRT<213> Coronavirus<400> 1Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys1 5 10 15Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val20 25 30Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile35 40 45Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu50 55 60Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn65 70 75 80Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg85 90 95Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro100 105 110Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr115 120 125Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe130 135 140Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr145 150 155 160Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr165 170 175Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln180 185 190Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro195 200 205Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ala Phe Gly Gly Val210 215 220
FPI03172-sequence list.txtSer Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu225 230 235 240Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp245 250 255Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe260 265 270Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser275 280 285Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His290 295 300Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser305 310
权利要求
1.一种重组蛋白质，具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加，且具有与(a)中蛋白质相同功能的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的重组蛋白质作为SARS病毒抗原的用途。
3.一种权利要求1所述的重组蛋白质在制备SARS疫苗中的用途。
4.一种权利要求1所述的重组蛋白质在制备治疗SARS药物中的用途。
5.一种权利要求1所述的重组蛋白质肽在制备诊断SARS试剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种重组蛋白质，其为具有SARS病毒S蛋白345～655位的氨基酸序列的蛋白质，或是该氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有相同功能的蛋白质。该重组蛋白质是SARS病毒识别宿主细胞表面受体的功能结构区，可以用于SARS病毒的抗原，或是用于制备SARS疫苗，制备治疗SARS的药物，以及制备诊断SARS的试剂。
文档编号G01N33/569GK1631896SQ200310122418
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者陈慰峰, 王月丹, 李燕 申请人:北京大学