一种重组靶向蛋白及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种重组祀向蛋白及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，类型超过100种，几乎可W发生在人体任何部位，且预 后差、极易复发，死亡率和患病率逐年上升，已成为人类疾病死亡的最主要病因。目前，针对 恶性肿瘤患者的临床治疗方法W手术治疗结合放疗、化疗为主，而晚期恶性肿瘤确诊时手 术时机往往丧失，放疗、化疗又不甚敏感。并且放疗、化疗不仅对肿瘤细胞具有杀伤作用，对 正常细胞也会产生不可逆的损伤。残酷的现实直接导致全世界恶性肿瘤患者5年平均生存 率仅为30%~40%，发达国家W不计成本的方式治疗也只能将个别恶性肿瘤类型患者的5 年平均生存率提高至50%~60%。因此，探索和开发高效、安全、廉价的抗肿瘤药物依然是 当前全球肿瘤研究和治疗机构的迫切任务和重要努力方向。
[0003] 由于具有特异、高效和免疫重建等功能，基于肿瘤特异性抗体和特异性抑癌基因 的肿瘤免疫导向治疗渐受关注，将其作为恶性肿瘤药物治疗和手术辅助治疗的手段正成为 恶性肿瘤新型治疗策略而倍受推崇。抗体介导的肿瘤祀向治疗是肿瘤生物治疗领域的主要 研究内容之一。但该领域的研究仍有一些问题有待于解决。首先，作为导向工具的肿瘤特 异性抗体存在分子量大、穿透力弱、稳定性差等不足，而且大多为鼠源性抗体，应用于人体 易产生人抗小鼠抗体，既影响治疗效果，又可能诱发过敏反应。其次，多数导向药物只考虑 了对肿瘤细胞的特异性识别并一味追求杀伤效果，而忽略了肿瘤特异性杀伤的重要性，从 而致使导向药物存在损伤正常组织或细胞的潜在隐患。运些在很大程度上限制了肿瘤免疫 导向治疗制剂的研究步伐。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组祀向蛋白及其制备方法与应 用。
[0005] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] 本发明的一种重组祀向蛋白，包括修饰的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白 片段。
[0007] 优选的，本发明的一种重组祀向蛋白具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0008] 进一步的，所述修饰的CEAscFvT84.66片段为CEAscFv骨架区中空间距离最近 的化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分别替换为半脫氨酸。
[0009] 本发明还提供了编码所述重组祀向蛋白的DNA分子。
[0010] 本发明还提供了编码SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的DNA分子，其具有如SEQID NO:2所示的核巧酸序列。
[0011] 本发明还提供了上述重组祀向蛋白的制备方法，包括：
[0012] 步骤1 :获取编码Apoptin蛋白片段的DNA分子和编码修饰的CEAscFvT84. 66片 段的DM分子；
[0013] 步骤2:将步骤1所获得的编码Apoptin蛋白片段的DM分子与编码修饰的CEA scFvT84. 66片段的DM分子连接，与表达载体融合后，转化宿主细胞；
[0014] 步骤3:诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离后纯化复性。
[0015] 进一步的，步骤1中，所述获取编码Apoptin蛋白片段的DNA分子具体为：W pVAXl-Apoptin为模板，用具有SEQIDN0:3所示的核巧酸序列的上游引物和具有SEQID N0:4所示的核巧酸序列的下游引物扩增编码Apoptin蛋白片段的DM分子。
[0016] 进一步的，步骤1中，所述获取编码修饰的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子为人 工合成包含修饰的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子的质粒，酶切后获得编码修饰的CEA scFvT84. 66片段的DNA分子。
[0017] 进一步的，步骤2中，所述表达载体为祀T28a，所述宿主细胞为大肠杆菌化21。 [001引本发明还提供了上述重组祀向蛋白在制备抗肿瘤的药物中的应用。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 1、本发明所述重组祀向蛋白包括修饰的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白片 段，W修饰的CEAscFvT84.66片段作为肿瘤特异性识别单元，WApoptin作为肿瘤特异性 杀伤单元，形成高效、安全和廉价的特异性抗肿瘤重组祀向蛋白。
[0021] 2、本发明结合生物信息学方法与已知癌胚抗原特异性单链抗体核巧酸序列，经分 子设计和密码子优化后，通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体基因片段，将肿瘤 特异性调亡诱导基因Apoptin通过一段柔性连接肤连接在单链抗体基因CEA scdsFv片段 下游，并克隆入大肠杆菌表达载体，转化宿主细胞，经IPTG诱导后表达获得本发明所述特 异性抗肿瘤重组祀向蛋白。SDS-PAGE和Western Blot分析表明，本发明所述重组祀向蛋白 得到良好表达，经条件优化后表达量最高可达44.Img/L。
[0022] 3、本发明所述重组祀向蛋白经分步洗涂法初步纯化和谷脫甘肤复性后，利用人肝 癌细胞对所制备重组祀向蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性 分析。结果显示，所制备的重组祀向蛋白能够有效的与上述肿瘤细胞结合，并对其具有明显 的杀伤活性。表明本发明所述重组祀向蛋白可用于制备抗肿瘤的药物。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中CEAscdsFv的分子模拟结果。
[0024] 图2为实施例1中重组祀向蛋白CAtinWesternBlot检测及纯化分析的结果图；其 中图A为重组祀向蛋白CAtin和CEA dsFv纯化前的Western Blot检测结果图，图B为重 组祀向蛋白CAtin和CEA dsFv纯化前的SDS-PAGE结果图，图C为重组祀向蛋白CAtin和 CEA dsFv纯化后的Western Blot检测结果图，图D为重组祀向蛋白CAtin和CEA dsFv纯 化后的SDS-PAGE结果图；各图中：1为原核表达的CAtin ;2为原核表达的CEA dsFv ;3为蛋 白marker ;4为纯化的的CAtin ;5为纯化的CEA dsFv。
[00对图3为实施例2中重组祀向蛋白CAtin结合活性检测结果图；其中图A为重组祀 向蛋白CAtin,图B为阴性细胞。
[0026]图4为实施例4中重组祀向蛋白CAtin杀伤活性检测结果图。
【具体实施方式】
[0027] W下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0028] CEA是一种分子量约180-200kDa的高度糖基化癌胚蛋白，普遍存在于结肠癌、乳 腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞表面。人源化CEA scFv T84. 66具有良好的结合活性，并具有穿 透力强、廓清快、异源性低等优点，但有时scFv比其亲本抗体的亲和力明显降低，并常常显 示聚集倾向，尤其在37°C时scFv的稳定性较差。
[0029] 而Apoptin可特异性地诱导肿瘤细胞发生调亡，而对正常细胞无作用。在正常细 胞内Apoptin主要定位在细胞浆，而在肿瘤细胞内Apoptin主要集中于细胞核，并且其第 108位苏氨酸在肿瘤细胞内特异性的憐酸化。此外，部分应用于肿瘤治疗的化疗药物和放射 性同位素是通过野生型P53诱导肿瘤细胞调亡而发挥作用的，但大多数肿瘤在其发展中往 往发生P53突变，从而影响放化疗效果，而ApoptinW非p53依赖性途径诱导细胞调亡，也 不受bd-2的抑制，且bcl-2还能增强其调亡诱导作用。
[0030] 本发明所说的重组祀向蛋白包括修饰的CEAscFvT84. 66片段和Apoptin蛋白片 段，W修饰的CEAscFvT84. 66片段作为肿瘤特异性识别单元，WApoptin蛋白片段作为肿 瘤特异性杀伤单元，形成特异性抗肿瘤重组祀向蛋白，命名为CAtin。
[0031] 其中，所说的修饰的CEAscFvT84. 66片段为CEAscFv骨架区中空间距离最近的 化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分别替换为半脫氨酸。本发明通过分子模 拟和氨基酸序列分析，在不改变CEAscFv互补决定区的条件下，将CEAscFv骨架区中空间 距离最近的化第106位的精氨酸和VH第43位的谷氨酷胺分别替换为半脫氨酸，在VH和 化之间导入链间二硫键将scFv改构为scdsFv，形成CEA二硫键稳定性单链抗体基因片段 即CEAscdsFv，显著提高其稳定性。 阳03引本实施方式中，所说的重组祀向蛋白CAtin其具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列。本发明也提供了编码所述重组祀向蛋白CAtin的DNA分子。由于密码子的简并性， 可W存在很多种能够编码本发明所说的特定多肤的核巧酸序列。本发明提供了编码SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的DM分子，其具有如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列。
[0033] 为了制备本发明所述重组祀向蛋白CAtin,本发明也提供了所述重组祀向蛋白 CAtin的制备方法，包括：
[0034] 步骤1:获取编码Apoptin蛋白片段的DNA分子：W pVAXl-Apoptin为模板，用具 有SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列的下 游引物扩增编码Apoptin蛋白片段的DNA分子；
[0035] 获取编码修饰的CEA scFvT84. 66片段的DNA分子：人工合成包含修饰的CEA scFv T84. 66片段的DM分子的质粒，酶切后获得编码修饰的CEA scFv T84. 66片段的DM分子。
[0036] 目前利用基因工程技术获得目的DM分子的方法有很多种，包括利用限制性内切 酶酶切具有编码目的DNA分子的载体或W具有编码所述目的DNA分子的cDNA为模板PCR 扩增。
[0037] 步骤2:将步骤1所获得的编码Apoptin蛋白片段的DNA分子与编码修饰的CEA scFv T84. 66片段的DNA分子连接，连接后，通过凝胶电泳回收和双酶切插入表达载体，与 表达载体融合后，构建重组表达载体，并转化宿主细胞。
[0038] 本领域技术人员可W理解本发明中所选用的表达载体可W为pGEX系列、pET系 列、PQE系列和pMAL系列等表达载体。在一些优选实施方案中，本发明所述表达载体为祀Τ系列中的祀T28a。
[0039] 本发明的转化宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和化21系列菌 株。优选的，宿主细胞为化21菌株。
[0040] 步骤3 :IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主细胞，收集菌体超声波破碎，取上清 经纯化复性后，获取重组祀向蛋白CAtin。SDS-PAGE和WesternBlot分析表明，本发明所 述重组祀向蛋白得到良好表达，表达量最高可达44.Img/L。
[0041] 纯化：分离后采用分步洗涂法纯化目的重组祀向蛋白：采用8M至0M脈素对目的 重组祀向蛋白进行梯度洗脱。
[0042] 复性：采用谷脫甘肤对目的重组祀向蛋白进行复性：目的重组祀向蛋白加入氧化 型谷脫甘肤和还原性谷脫甘肤4°C放置8~1化后，用PBS透析。氧化型谷脫甘肤的终浓度 为ImM，还原性谷脫甘肤的终浓度为2mM。
[0043] 本发明结合生物信息学方法与已知癌