一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其设及一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特 异性抗体。
【背景技术】 W02]CD16A(Fc丫RIIIA)是一种跨膜结构的IgGFc受体，有190AA的胞外区和25AA的胞内区，属于Ig超家族成员，主要分布于NK(naturalkiller,自然杀伤）细胞、巨隧 细胞和嗜酸性粒细胞表面。抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，简称ADCC)是抗体的一种重要的效应功能，当抗体与祀细胞（比如肿瘤细 胞)结合W后，抗体的Fc端可通过Fc受体（CD16A)与NK细胞结合并激活NK细胞，后者通过 释放颗粒酶及穿孔素等将祀细胞杀死。CD16A介导NK细胞和单核巨隧细胞的ADCC作用，在 特异性和非特异性免疫中具有重要作用，是机体清除免疫复合物和肿瘤细胞的关键受体。 因此WCD16A分子为祀标的BsAb(双特异性抗体）对于引导NK(naturalkiller,自然杀 伤）细胞和巨嗜细胞可能具有优势。
[0003] MUCK粘蛋白1)是一种具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其cDNA克隆是通过筛选从乳 腺癌、膜腺癌等细胞系构建的cDNA表达文库而得到的。MUC1在乳腺正常及瘤组织中均有表 达，但在正常腺细胞表达很低，主要分布于腺细胞表面，呈顶端表达，或W分泌形式存在于 腺腔内，不被免疫系统识别。MUC1在癌组织中存在崎形糖基化和糖基化不完全，使MUC1的 核屯、蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整个癌细胞表面，可为免疫系统识别， 成为肿瘤特异的抗原，大约90%W上的乳腺癌有MUC1的过度表达。Rahn和Soares等采 用免疫组化对乳腺癌及良性乳腺病变进行了研究，结果表明，正常乳腺上皮细胞可见MUC1 弱阳性表达，MUC1在乳腺癌组织中的高表达与乳腺良性病态组织及乳腺正常低表达之间存 在显著性差异。而乳腺良性病变组织中MUC1表达无显著差异，证实了MUC1基因的编码产 物是重要的癌标志物。此外，最近的研究还发现，肿瘤细胞MUC1可抑制嗜酸粒细胞对祀细 胞的ADCC作用。Ogata等报道含有S化表位的MUC1可大大提高锭离子对NK细胞的抑制作 用；随后又有报道转染MUC1cDNA的肿瘤细胞对杀伤细胞的敏感性降低，肿瘤细胞分泌的 MUC1可抑制T细胞的增殖，使其处于G0/G1期，运些研究均表明MUC1对抗肿瘤的细胞免疫 应答具有抑制作用。因此，MUC1是肿瘤特异性免疫治疗理想的祀分子。目前，已有多家研 究机构制备了多种MUC1单克隆抗体，其中56株已得到国际肿瘤生物医学协会（IS0BM)的 确认，但由于疗效有限，远不能满足现实需求。
[0004] 双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb)是具有两个抗原结合位点，可选择 性募集效应细胞到祀细胞周围，介导特异性杀伤作用的新型人工抗体。通过BsAb介导免疫 细胞杀死肿瘤细胞是当前肿瘤免疫治疗应用研究的热点，其主要作用机理是BsAb能同时 结合肿瘤相关抗原和免疫细胞上的祀分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀 伤。目前双特异性抗体的结构主要WScFv为主，仅由两种抗体的重链可变区和轻链可变区 构成。由于ScFv构型的双特异性抗体分子量小，结构不稳定，导致在体内半衰期短，易被清 除，难w达到有效杀伤肿瘤细胞的目的。
【发明内容】
阳005] 针对W上技术问题，本发明公开了 一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗 体，基于现有技术中的单一识别在肿瘤治疗中疗效不足的问题，本发明公开了一种能够同 时结合肿瘤相关抗原和免疫细胞祀分子的双特异性抗体，在识别肝癌细胞MUC1抗原，诱导 ADCC的同时，识别免疫效应细胞的CD16A抗原，有效地引导免疫效应细胞对肿瘤细胞的特 异性杀伤。
[0006] 对此，本发明采用的技术方案为： 一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体，包含： 特异性识别免疫效应细胞的CD16A抗原的第一功能域， 特异性识别肝癌细胞MUC1抗原的第二功能域，和 连接上述功能域的接头。 阳007] 作为本发明的进一步改进，抗CD16A抗体的轻链可变区（VL)与抗MUC1抗体的重链 可变区（VH)通过G4S序列连接构成第一ScFv区，抗MUC1抗体的化和抗CD16A抗体的VH通过G4S序列连接构成第二ScFv区，所述第一ScFv区和第二ScFv区通过longlinker串 联；其中，所述抗CD16A抗体的化氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，抗MUC1抗体的VH氨基 酸序列如SEQIDN0:2所示、抗MUC1抗体的化氨基酸序列如SEQIDN0:3所示和抗CD16A 抗体的VH氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，具体如下： 沈QIDNO:1 : DTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVD抑細SFMNWYQQKPGQPP化LIYTTSNLESGIPASFSASGSGT DFTLNIHPVE邸DTATYYCQQS肥DPYTFGGGTKLEIK ; 沈QIDNO:2 : QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMT畑TSIRTAYMELS化RS孤TAMYYCAREVTGDRGQ抑KWGQGTLVTVAS; 沈QIDNO:3 : QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGG順IGSKSV册YQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGI阳RFSGSNSGNTATLT ISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTTL ; 沈QIDNO:4 : QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGF化STSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWW孤DKRYNPALKS化TISK DTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSSo
[0008] 作为本发明的进一步改进，所述longlinker的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
[0009]沈Q ID NO :5 :GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS。
[0010] 作为本发明的进一步改进，所述第二ScFv区同时与IgGl的C肥域和C册域连接， IgG的前导肤序列为信号肤。 1] 采用此技术方案，将ScFv与Fc进行结合，采用ScFv-Fc构型，增加双抗的稳定性， 有效延长双抗的半衰期，并通过Fc结构域介导的ADCC途径，有效的增强双抗杀瘤能力。 [0012] 作为本发明的进一步改进，所述抗MUC1抗体为巧95,所述抗CD16A抗体为 EPR4333〇
[0013] 本发明还公开了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUCl抗原的双特异性抗体的核巧 酸序列。
[0014] 本发明还公开了包含上述核巧酸序列的载体。 阳015] 本发明还公开了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体在制备 治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
[0016] 本发明的有益效果为： 第一，采用本本发明的技术方案，克服了现有技术中的单一识别在肿瘤治疗中疗效不 足的问题，同时又克服了ScFv构型的双特异性抗体分子量小，结构不稳定，半衰期短，易被 清除的技术问题，将ScFv与Fc进行结合，采用ScFv-Fc构型，增加双抗的稳定性，有效延长 双抗的半衰期。 阳017] 第二，采用本本发明的技术方案，所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性 抗体在识别肝癌细胞MUC1抗原，诱导ADCC的同时，能识别免疫效应细胞的CD16A抗原，增 强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，有效地引导免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤， 选择性杀伤肿瘤细胞，副作用小。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体序列结构示意 图。
[0019] 图2是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的SDS-PAGE蛋 白电泳图。
[0020] 图3是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的流式结果图。 阳02U 图4是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的体外细胞毒 分析图。
[0022] 图5是本发明一种实施例在浓度为50nM下的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的 双特异性抗体与单独单抗组、同时添加两种单抗组的体外细胞毒对比分析图。 阳02引图6是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体的细胞因子分 泌水平图。
[0024]图7是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体与生理盐水组 和单纯NK组对照的体内介导NK抑制体内肿瘤增殖的对比图。 阳025] 图8是本发明的一种抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的双特异性抗体与生理盐水组 和单纯NK组对照的肿瘤模型鼠生存率对比图。
【具体实施方式】