一种改良的双抗原夹心免疫检测法的制作方法

专利名称：：一种改良的双抗原夹心免疫检测法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫检测领域，具体地说，是涉及一种改良的双抗原夹心免疫检测法。
背景技术：
：免疫检测是应用免疫学技术测定标本中待测物质的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。根据检测原理的不同，免疫检测可以分为间接法、夹心法(包括双抗原夹心法和双抗体夹心法)、捕获法、竞争法等。双抗原夹心法属于夹心法的一种，广泛应用于免疫检测领域。其基本原理是用特异性抗原进行包被和制备标记结合物，通过两次免疫结合，形成包被抗原-抗体-标记抗原复合物，完成待测抗体的检测。根据抗原标记物及检测技术的不同，双抗原夹心法又可进一步具体应用于酶联免疫(ELISA)、快速诊断(包括基于胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶等的快速诊断)、放射免疫、荧光免疫等检测中。酶联免疫的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。双抗原夹心ELISA法，是双抗原夹心免疫检测法在ELISA检测上面的一个具体应用。在测定时，受检标本中的抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方式使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检抗体的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产3物的量与标本中受检抗体的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。故双抗原夹心ELISA法广泛应用于传染病等项目的抗体检测，具有灵敏度高，特异性好的特点。快速诊断检测采用胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶等标记物，利用此类标记物可以牢固吸附在抗原/抗体的表面而不影响抗原/抗体的活性，当标记抗体/抗原与待测标本中的抗原/抗体反应聚集到一定浓度时，可以直接呈现颜色，从而达到快速诊断的效果。快速诊断检测又可进一歩具体为斑点渗滤法，免疫层析法等。免疫层析法是上世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体/抗原先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体/抗原的区域时，样品中相应的抗原/抗体即与该抗体/抗原发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。双抗原夹心免疫层析法，是双抗原夹心免疫检测法在免疫层析检测上面的一个具体应用，此方法检测待测样品中的目标抗体，具有迅速便捷的优势。化学发光免疫观lj定(Chemiluminescentimmunoassay,CLIA)是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。放射免疫测定法将放射性的灵敏度与免疫的特异度相结合，既简便准确又灵敏可靠。双抗原夹心法均可具体应用于这两种检测方法。但是，双抗原夹心法在具体实施时，常常会由于试剂、材料、环境等因素，特别是待测样品中的一些干扰性物质会引起非特异性结合，导致有一定程度的假阳性，影响了检测结果的可信度。常规的处理方法就是调低包被或者标记抗原的用量，提高抗原纯度，严格控制双抗原夹心法试剂盒材料的质量等方面去缓解。但是调低包被或者标记抗原的用量势必会降低检测的灵敏度，提高抗原纯度也不可能使抗原纯度达到百分之百，试剂盒材料的质量也不是自己可以随意可调控的因素。因此双抗原夹心法检测目4的抗体时，背景过高以及假阳率高始终是一个难以解决的问题。为此，必须寻求一种方法来降低双抗原夹心法的背景和假阳率，提高检测的特异性。
发明内容发明目的本发明的目的就是为了提供一种改良的双抗原夹心免疫检测法，降低检测的背景和假阳率，提高检测的特异性。技术方案在双抗原夹心法检测样品时，有多种因素可能导致假阳，包括操作员，待测样品本身含有的干扰性物质，试剂盒所采用的抗原抗体以及其它辅料等等因素。在这些因素当中，检测中由于样品含有的干扰性物质的非特异性结合是引起假阳的重要因素。非特异性结合的是指在待测样品中除待测抗体以外的其他物质与包被抗原或者检测系统中的固相支持物结合，使得检测结果为假阳。为了减少和降低这种非特异性结合，本发明将抗人IgG加入到检测体系中，利用抗人IgG的非特异性结合特性，使其与待测样品中的其他蛋白或者抗体产生非特异性的结合，由于这种结合将对两者的空间构象产生影响，增大了非待测抗体与包被抗原或者标记抗原产生非特异性结合的空间位阻，降低了结合的几率，从而降低了由于非特异性结合的干扰带来的假阳。而对于待测抗体，由于抗原抗体间的结合是特异性的，抗人IgG即使结合到待测抗体上，对灵敏度的影响不大(可参看实施例中的具体试验数据)。进一步具体来说，本发明将抗人IgG单克隆抗体或者多克隆抗体，以合适的使用比例加入到双抗原夹心法检测的反应体系之中，例如将抗人IgG单克隆抗体或者多克隆抗体加入到ELISA检测法的样品稀释液、免疫层析检测法的加样垫或者标记物垫上，按照免疫层析试剂盒的一般结构组装成双抗原夹心法检测试剂盒。因此，本发明提供一种改良的双抗原夹心免疫检测法，此方法在双抗原夹心法的反应体系中加有抗人IgG抗体。通过抗人IgG在检测体系中的作用，尤其是抗人IgG抗体与检测体系中各种成分的复合作用的综合影响，达到最终降低假阳的效果。本发明中利用的抗人IgG经验证可以是单克隆抗体，多克隆抗体。通过一系列的实验证明了抗人IgG在双抗原夹心法中具有普遍适应性。本发明可以应用于酶联免疫法、快速检测法、放射免疫检测法、荧光免疫检测法等，相应的，其标记物可以是酶、胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质。更进一歩，本发明公开了该方法在快速诊断检测中的应用。可将抗人IgG抗体加入加样垫或标记物垫。相应的，本发明公开了上述方法制备的快速诊断检测试剂盒，由PVC底板、加样垫、标记物垫、NC膜、吸水纸、对照线和检测线组成，在加样垫或者标记物垫中含有抗人IgG抗体。此外，本发明还公开了该方法在酶联免疫检测上的应用，具体可将抗人工gG抗体加入样品稀释液中。相应的，本发明公开了上述方法制备的酶联免疫检测试剂盒，由多孔板、样品稀释液、酶结合物稀释液、显色液组成，在样品稀释液中加有抗人IgG抗体。实施例的数据证明了抗人IgG在双抗原夹心法的应用可以在不影响检测灵敏度的条件下，降低检测系统中由非特异性结合干扰所带来的假阳，保证检测的准确度。本发明的详细技术方案，将在以下的实施例中进行说明。实施例以双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒(H印atitisCVirus,HCV)抗体和梅毒螺旋体(Tr印onemaPallidum,TP)抗体为例详细阐述，对于其它项目的双抗原夹心法，本领域的普通技术人员可以以此类推。需要说明的是，在现有技术中，采用捕获法测定特异IgM时，也有人在样品稀释液中加入抗人IgG抗体。之所以加入抗人IgG抗体，是因为样品中的IgG抗体会跟待测IgM抗体竞争性的结合抗原标记物，导致检测的灵敏度降低；加入抗人IgG抗体，会减少这种竞争性结合，保证了IgM检测的灵敏度。所以说，这项现有技术，和本发明的技术是有很大区别的。发明优点本发明通过引入抗人IgG实现了对双抗原夹心法的改良，在现有技术的灵敏度条件下，大大降低了检测的背景和假阳率，提高了检测的特异性。具体实施例方式本发明的目的、技术方案及优点将结合实施例作进一步详细阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献(萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯，等.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南[M].北京科学出版社，1992)中所述的条件，或者试剂盒生产厂家推荐的方法进行，在此不必赘述。实施例1加样垫加有抗人IgG多克隆抗体的HCV双抗原夹心法金标试纸条1.1HCV包被抗原的制备PCR扩增丙型肝炎病毒基因NS3部分如SEQIDNO.1所对应的DNA区段(属于NS3蛋白的一部分)，其上游引物如SEQIDN0.2所示，带有BamHI位点，下游引物如SEQIDN0.3所示，带有HindIII位点。PCR的片段经回收之后，用BamHI和HindIII酶切，连接到用BamHI和HindIII酶切之后的PQE30载体(Qiagen公司)中，得到的阳性重组质粒PQE30-NS3。将质粒PQE30-NS3转化ER2566菌(美国NewEnglandBiolabs公司)，用500ml含lOOug/ml氨苄西林钠(上海生工生物工程技术服务有限公司，货号A0339)的LB培养基37t:振荡培养至OD600=1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(上海生工生物工程技术服务有限公司，货号IB0168)，37。C诱导4小时。74°C5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重悬，超声破碎，4°C12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，部分目的蛋白分布在包涵体。包涵体用含2%TritonX_100(上海生工生物工程技术服务有限公司，货号T0694)的溶液I(20mMTirs-HCl，pH8.5，5mMEDTA，lOOmMNaCl)重悬，超声，4°C12000rpm离心20分钟收集包涵体，用溶液I配制的4M尿素溶解后，对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0,20mM)透析，换液3次，4°C12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原，用同一PB缓冲液平衡S印hacrylS_200凝胶柱(美国AmershamBiosciences公司)后将上述粗抗原过柱，收集合并含目的蛋白的溶液，用平衡缓冲液(10mMNa2HPO"1.8mMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKC1，25mM咪唑(美国Sigma-Aldrich公司，货号15513)，pH8.0)充分透析。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入透析之后的蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脱目的蛋白，再用PB缓冲液透析，去除咪唑，测定蛋白浓度，蛋白命名为PQE-NS3，此为本发明的包被抗原。1.2HCV标记抗原的制备将上述经过BamHI和HindIII酶切之后的NS3片段连接到经过BamHI和HindlII酶切之后的PET-30a载体(Novagen公司，货号69909-3)中，得到的阳性重组质粒PET30a-NS3转化ER2566菌，用500ml含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，货号KB0286)的LB培养基37。C振荡培养至0D60(^1.0左右，用终浓度为O.5mM的IPTG，37。C诱导4小时。4°C5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液重悬，超声破碎，4°C12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，部分目的蛋白分布在裂解液包涵体。后续纯化步骤和PQE-NS3—样，纯化得到的蛋白命名为30a-NS3，此为本发明的标记抗原。81.3胶体金的制备在三角烧瓶中加入100ml超纯水，磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入lml1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加入lml1%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号6132-04-3)水溶液，继续沸腾10分钟，然后自然冷却即可。1.4HCV抗原-胶体金标记物的制备取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入150ul的0.2MK^03调节pH至7.0，继续搅拌30秒；加入150-300ug的HCV标记抗原30a-NS3，继续搅拌10分钟；加入O.lml10%BSA，继续搅拌5分钟；5000g离心10分钟，吸出上清，将沉淀收集至一合适容器；对上清再用10000g离心15分钟，重复第一次离心的操作；对上清再用12000g离心30分钟，弃掉上清，将三次离心的沉淀收集到同一离心管中，用胶体金稀释液(20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.l%TritonX-100，2%Sucrose，0.01%Proclin300)定容至lml充分混匀后放-4'C保存。1.5试纸条的组装将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后以0.45u1/腿2加到标记物垫上，_50°0真空冷冻干燥5&后于41:存放，即制成标记物垫。鼠抗人IgG多克隆抗体，采用一般实验室的制备方法，在此并无特别之处，所以不需要赘述。将鼠抗人IgG多克隆抗体用PBS缓冲液稀释到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4,0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分别浸泡玻璃纤维(Watman公司)，-5(TC真空冷冻干燥6h后于4。C存放，作为加样垫。没有加鼠抗人IgG多克隆抗体的PBS作为对照。用检测线稀释液(lOmMPBS+2。/。蔗糖)稀释HCV包被抗原PQE-NS3以及对照线抗体到工作浓度，分别为2.Omg/ml和1.Omg/ml，随后用点膜仪(喷液量均为0.05ul/匪，喷液速度为70ml/S)分别包被在硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号HF135002)上，形成间隔0.5cm的测试线(T线)和质控线(C线)，室温晾干。将h述标记物垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、PVC底板、加样垫等辅料组装成HCV金标双抗原夹心法检测试纸条。1.6试纸条的检测方法加100ul待测样品(例如饥清)到加样垫处，室温放置20分钟之后，判定结果。结果判定标准如下①仅质控区出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性(-);②有两条条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，表示阳性(十)；③质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或试纸条己变质损坏。在此情况下，应用新的试纸条重新测试。1.7检测结果选用经过RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)验证过的100份HCV阳性血清和3000份阴性血清，同时用本发明加样垫用鼠抗人IgG多克隆抗体预处理之后的HCV金标双抗原夹心法检测试纸条，以及本发明的对照试纸条来检测，得到了表l的结果。表1:不同浓度的鼠抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条假阳性评价<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>对于100份阳性血清，本发明试纸条和对照试纸条都全部检出，且信号强度差别不大。对于3000份阴性血清，对照试纸条有77份检出(假阳)，假阳率为2.57%，在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗体处理之后的加样垫制备的试纸条有17份检出(假阳)，假阳率为0.57%，二者有显著差异。我们将100份经过RIBA2.0验证过的HCV阳性标本，用PBS稀释25、50、100、200倍，以及不稀释作为对照，考察不同浓度的鼠抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度，得到的结果如表2所示。表2:不同浓度的鼠抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度情况鼠抗人IgG多克隆抗体的浓度(mg/ml)PBS对照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0标本稀释倍数ioo份标本中检出阳性数110010010010010010010010010010099982510010010010010010010010010099958950999999999998989897959176100979797979796969693928361200848383818079787874716549从表2可以看出，抗人IgG的浓度越高，对灵敏度的影响越大，在8.0和10.0mg/ml时，原倍的标本也有漏检，说明，并不是抗人IgG的使用浓度越高，效果越好。综合表1和表2的结果，为了同时保证试纸条有最佳的灵敏度和最好的特异性，本发明的加样垫上鼠抗人IgG多克隆抗体的使用浓度是0.055.Omg/ml，优选为0.54.Omg/ml，更优选为2.03.Omg/ml。实施例2标记物垫加有抗人IgG多克隆抗体的HCV双抗原夹心法金标试纸条分别参见实施例l.l、1.2、1.3、1.4制备HCV包被抗原、HCV标记抗原、胶体金以及标记抗原-胶体金复合物。2.5试纸条的组装将鼠抗人IgG多克隆抗体用PBS缓冲液稀释到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3,0、4.0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分别浸泡玻璃纤维(Watman公司)，-5(TC真空冷冻干燥6h后于4r存。没有加鼠抗人IgG多克隆抗体的PBS作为对照。将标记抗原-胶体金复合物用胶体金稀释液10倍稀释后以丄/irrf加到上述加有鼠抗人IgG多克隆抗体处理之后的玻璃纤维上，-5(TC真空冷冻干燥5h后于4'C存放，即制成标记物垫。用检测线稀释液(10mMPBS+2》〕蔗糖)稀释HCV包被抗原PQE-NS3以及对照线抗体到工作浓度，分别为2.Omg/ml和1.OmgZml，随后用点膜仪(喷液量均为0.05ul/mm，喷液速度为70ml/S)分别包被在硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号HF135002)上，形成间隔0.5cm的测试线(T线)和质控线(C线)，室温晾十。将上述标记物垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、PVC底板、加样垫等辅料组装成HCV金标双抗原夹心法检测试纸条。2.6试纸条的检测方法参见实施例1.6进行检测。2.7检测结果选用经过RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)验证过的100份HCV阳性血清和3000份阴性血清，同时用本发明加样垫预处理之后的HCV金标双抗原夹心法检测试纸条，以及本发明的对照试纸条来检测，得到了表3的结果。表3:不同浓度的鼠抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条假阳性评价鼠抗人IgG多克RIBAPBS对照隆抗体的浓度2.0对照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0(mg/ml)阳性检出份数1001001001001001001001001001001009898检出率(%)1001001001001001001001001001001009898假阳检出份数0773431282423211920202120假阳率02.571.131.030.930.800.770.70C.630.670.670.700.67对于100份阳性血清，本发明试纸条和对照试纸条都全部检出，且信12号强度差别不大。对于3000份阴性血清，对照试纸条有77份检出(假阳)，假阳率为2.57%,在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗体处理之后的加样垫制备的试纸条有19份检出(假阳)，假阳率为0.63%，二者有显著差异。我们将100份经过RIBA2.0验证过的HCV阳性标本，用PBS稀释25、50、100、200倍，以及不稀释作为对照，考察不同浓度的鼠抗人工gG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度，得到的结果如表4所示。表4:不同浓度的鼠抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度情况鼠抗人IgG多克隆抗体的浓度(mg/ml)PBS对照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0标本稀释倍数ioo份标本中检出阳性数110010010010010010010010010010098972510010010010010010010010010099948750999999999998989797%90741009797979796%%9593918362200848484848281797874716651从表4可以看出，鼠抗人IgG多克隆抗体的浓度越高，对灵敏度的影响越大，在8.0和10.0mg/ml时，原倍的标本也有漏检，说明，并不是鼠抗人IgG多克隆抗体的使用浓度越高，效果越好。综合表3和表4的结果，为了同时保证试纸条有最佳的灵敏度和最好的特异性，本发明的加样垫上鼠抗人IgG多克隆抗体的使用浓度是0.055.0mg/ml，优选为0.54.Omg/ml，更优选为2.03.Omg/ml。实施例3加样垫或者标记物垫加有抗人IgG单克隆抗体的HCV双抗原夹心法金标试纸条参见实施例1、2，制备加样垫或者标记物垫加有抗人IgG单克隆抗体的HCV双抗原夹心法金标试纸条，最后得到了跟实施例1.7和2.7类似的结果，这说明，在加样垫或者标记物垫加入抗人IgG单克隆抗体或者多克隆抗体都可以提高金标试纸条检测的特异性。实施例4样品稀释液加有抗人IgG多克隆抗体的HCV双抗原夹心法ELISA13试剂盒分别参见实施例1.1、1.2制备HCV包被抗原、HCV标记抗原。4.3HCV标记抗原-HRP标记物的制备HCV标记抗原和服P的偶联采用Nal04氧化法。称取10mg辣根过氧化物酶(HRP，美国SIGMA公司，货号P8375)溶解于lml超纯水中，再缓慢滴加lml超纯水新鲜配制的5mg/mlNaI04(生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后加入20%乙二醇(生工，货号E0582)溶液0.05ml，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入事先对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析2小时，2.5mg/ml的纯化好的30a_NS3抗原lml，4。C避光对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析过夜。次日，向混合物中滴加0.lml新鲜配制的4mg/mlNaBH4(生工，货号ST1268)溶液，混匀，4。C静置2小时。将上述溶液装入透析袋中，对PBS缓冲液(150mM，pH7.4)透析，4。C过夜。加入酶保护剂及终浓度50。/。的甘油混匀后-2(TC避光保存备用，此标记物下文称为30a-NS3-HRP。4.4试剂盒的检测方法将PQE30-NS3抗原以一定比例用碳酸盐缓冲液(50mM，pH9.51)稀释，100ul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)，4。C包被24小时，次日用PBST(10mMPB，150raMNaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干，120ul/孔加入含30%新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，8%蔗糖，5%。酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司，货号C-8645)，150mMNaCl的pH7.4，lOmMPB封闭液，37。C封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25°C、湿度55%-65%、有通风设备的房间内风干。封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。在包被酶标板中每孔加入100ul样品稀释液(配方PH7.4PB，0.15MNaCl，20%NBS，0.5%明胶，1%Tween-20，0.04。％TtitonX-100，0.1%巯基乙醇，预先以1:10000，1:5000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50的稀释比例加入抗人IgG多克隆抗体，设阴性对照14样品稀释液，不加抗人IgG多克隆抗体)，50Ul待测样品、阴性参照样品(正常人阴性血清)、阳性参照样品(HIV抗体阳性血清)对照，37'C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。再100ul/孔加入含有20。/。新生牛血清，以一定比例稀释的30a-NS3-HRP缀合物的pH7.4的20mMPB缓冲液，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。每孔加入含0.5%。过氧化氢尿素(生工，货号UB1753)、4.76%。三水合乙酸钠、0.9。；冰醋酸的显色剂A及含0.32。；TMB(生工，货号TB0514)、5mM柠檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5。/。甲醇、2^。二甲基甲酰胺的显色剂B各50ul，37'C避光显色10分钟。每孔加50ul，含2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值。截值(CutoffValue(COV))计算COV二阴性对照平均OD值X2.0(阴性对照OD值低于0.075按0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值》COV为阳性，待测样品OD值〈COV为阴性。4.5检测结果选用经过RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)验证过的100份HCV阳性血清和3000份阴性血清，同时用本发明的样品稀释液加有抗人IgG多克隆抗体的HCV双抗原夹心法ELISA试剂盒，以及本发明的对照试纸条来检测，得到了表5的结果。表5:不同浓度的抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试剂盒假阳性评价样品稀释液中抗人IgG多克隆抗体的稀释比例RIBA2.0对照样品稀释液无抗人IgG多克隆抗体1000050002000100050020010050阳性检出份数检出率(%)假阳检出份数100100100100211001001001001009998971001001001001009998971913814假阳率(%)0.700.630.430.270.170.230.270.300.47对于100份阳性血清，本发明试剂盒在1:10000到1:500区间抗人IgG多克隆抗体处理条件下和对照试剂盒都全部检出，在l:200以及更高浓度抗人IgG多克隆抗体处理条件下，有漏检。对于3000份阴性血清，对照试剂盒有21份检出(假阳)，假阳率为0.70%，在本发明的试剂盒最好条件下，1:1000的抗人IgG处理条件下的试剂盒有5份检出(假阳)，假阳率为O.17%，二者有显著差异。我们将100份经过RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)验证过的HIV阳性标本，用PBS稀释25、50、100、200倍，以及不稀释作为对照，考察不同浓度的抗人IgG多克隆抗体加入样品稀释液之后制备的试剂盒灵敏度，得到的结果如表6所示。表6:不同浓度的抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试剂盒灵敏度情况<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果显示，抗人IgG多克隆抗体在l:10000至l:500的使用比例范围内，对试剂盒的灵敏度影响不大。综合表5和表6的结果，为了同时保证试剂盒有最佳的灵敏度和最好的特异性，本发明的试剂盒样品稀释液里抗人IgG多克隆抗体的使用比例是l:2000到l:500，最优选为l:1000。本发明又采用抗人IgG单克隆抗体重复了本实施例的实验，结果跟上述抗人IgG多克隆抗体的效果类似。实施例5加样垫加有抗人IgG多克隆抗体的TP双抗原夹心法金标试纸条5.1TP包被抗原的制备PCR扩增梅毒螺旋体17Kda(TP17)基因部分如SEQIDNO.4所对应的DNA区段，其上游引物如SEQIDNO.5所示，带有BamHI位点，下游引物如SEQIDNO.6所示，带有EcoRI位点。PCR的片段经回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体PET_32a中，得到重组质粒PET-32a-TP17，即本发明的包被抗原的重组质粒。质粒PET-32a-TP17转化ER2566(美国NewEnglandBiolabs公司)，用含100ug/ml氨苄西林钠的500mlLB培养基37"振荡培养至0D600=1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号IB0168)37。C诱导4小时。4°C5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，lmMEDTA，lOOmMNaCl)重悬，超声破碎，4°C12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液(广东光华化学试剂公司，货号7783-20-2，调pH7.4)至硫酸铵终浓度为30%，4。C静置30min，4°C12000g离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为60%，4。C静置30min，4°C12000g离心20分钟，收集沉淀，用5ml平衡缓冲液(10mMNa2HP04，1.8raMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKCl，25mM咪唑(美国Sigma-Aldrich公司，货号15513)，pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-2(rC保存备用，蛋白命名为32a-TP17。5.2TP标记抗原的制备用2.1中的TP17片段，连接到用BamHI和EcoRI双酶切处理之后的表达载体pGEX-6P-l(Phamacia公司，货号27-4597-01)中得到重组质粒pGEX-6P-1-TP17，即本发明的标记抗原的重组质粒，以下简称6P-TP17。上述阳性克隆，接种于含100ug/ml氨节西林钠(生工，货号A0339)的500mlLB培养基37。C振荡培养至OD600=1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG37。C诱导4小时。4°C5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重悬，超声破碎，4°C12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分口的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至石Jj充酸铵终浓度为25%，4'C静置30min，4。C12000g离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为45W，4t:静置30min，4'C12000g离心20分钟，收集沉淀，用10ml平衡缓冲液(pH7.3PBS，140mMNaCl，2.7mMKC1，lOraMNa2HP04，1.8mMNaH2P(M)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡GSTrap亲和柱(Amcrsham公司，货号17-5130-02)之后，加入蛋A样，用IO倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(50mMTris-HC1，10mM还原型谷胱甘肽(Araresco公司，货号0399)，pH8.0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-2(TC保存备用，蛋Q命名为GST-TP17。5.3胶体金的制备参见实施例1.3制备胶体金。5.4TP标记抗原-胶体金标记物的制备参见实施例].4制备TP标记抗原-胶体金标记复合物。5.5试纸条的组装参见实施例1.5组装加样垫加有抗人IgG多克隆抗体的TP双抗原夹心法金标试纸条。5.6检测方法参见实施例1.6进行检测。5.7检测结果选用经过梅毒螺旋体确诊试验(TPPA)验证过的100份TP阳性血清和3000份阴性血清，同时用本发明加样垫预处理之后的的TP金标双抗原夹心法检测试纸条，以及木发明的对照试纸条来检测，得到了表7的结果。表7:不同浓度的抗人TgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条假阳性评价抗人igc;rpp/ipk;gmq10205102fl"ino多克隆抗对照对照18体的浓度(mg/ml)阳性检出份数10010010。1001001001001001001001009897检出率(%)100100100100100丄OO100丄OO1001001009897假阳检出份数0483928242219181516161818假阳率(%)01.601.300.930.800.730.630.600.500.600.600.600.60对于100份阳性血清，本发明试纸条和对照试纸条都全部检出，且信号强度差别不大。对于3000份阴性血清，对照试纸条有48份检出(假阳)，假阳率为1.60%，在3.0mg/ml的抗人IgG多克隆抗体处理之后的加样垫制备的试纸条有15份检出(假阳)，假阳率为0.50%，二者有显著差异。.我们将100份经过梅毒螺旋体确诊试验(TPPA)验证过的TP阳性标本，用PBS稀释25、50、100、200倍，以及不稀释作为对照，考察不同浓度的抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度，得到的结果如表8所示。表8:不同浓度的抗人IgG多克隆抗体处理加样垫后制备的试纸条灵敏度情况抗人TgG多克隆抗体的PBS对照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0浓度(mg/ml)___IOO份标本中检出阳性数100100丄OO1001001001001001001009896100100100100100100100100100999489999999999898989897959078979797979796969594948165200_848483828281807978786151从表8可以看出，抗人IgG多克隆抗体的浓度越高，对灵敏度的影响越大，在8.0和10.0mg/ml时，原倍的标本也有漏检，说明，并不是抗人IgG多克隆抗体的使用浓度越高，效果越好。综合表7和表8的结果，为了同时保证试纸条有最佳的灵敏度和最好的特异性，本发明的加样垫上抗人IgG多克隆抗体的使用浓度是0.055.OmgZml，优选为0.54.Omg/ml，更优选为2.03.Omg/ml。标本稀释子;数12550100此外，在TP项目中采用本发明并进行实施例2-4类似的实验，结果显示本发明应用于TP项目与HCV项目有相似的检测效果，证明抗人IgG对TP项目同样具有改善假阳和提高检测特异性的效果。对于HCV、TP项目之外的其它项目，本发明也做了验证实验，结果基本跟上面的实施例类似，本
技术领域：
的研究人员根据本发明皆可实践，故这里不再赘述。序列表〈110〉深圳市菲鹏生物股份有限公司<120>—种经过改进的双抗原夹心法免疫层析试纸条〈160〉6<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>795<212〉腿〈213>南型肝炎病毒(H印atitisCvirus)<220〉<223〉丙型肝炎病毒NS3部分序列<■〉1CTAGAAACTACCACGCGGTCTCCGGTTTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCG60CAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCTCCTACTGGCAGCGGCAAGAGCACTAAAGTG120CCGGCTGCATATGCGGCCCAAGGGTACAAGGTGCTCGTCCTGAACCCGTCCGTTGCCGCC180ACCTTAGGTTTTGGGGCGTATATGTCTAAGGCACATGGTATCGACCCTAGCGTCAGGACC240GGGGTAAGGACCATCACCACGGGTAGCCCCATCACGTACTCCACCTATGGCAAGTTCCTT300GCTGATGGTGGTTGCTCTGGGGGTGCCTATGACATTATAATATGTGATGAGTGCCATTCA360ACTGACTCGACTACTATCTTGGGCATCGGCACGGTCCTGGACCAAGCGGAGACGGCTGGA420GCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACCGCTACGCCTCCGGGATCGGTCACCGTGCCACATCCC480AACATCCAGGAGGTGGCCCTGTCCAATACTGGAGAGATCCCCTTCTATGGTAAAGCCATC540CCCATCGAGGCCATCAGGGGGGGAAGGCATCTCATTTTCTGCCACTCCAAGAAGAAGTGT600GACGAGCTCGCTGCAAAGCTATCATCC、CTCGGACTCAACGCTGTGGCGTACTACCGGGGT660CTTGATGTGTCCGTCATACCATCTAGCGGAGACGTCGTTGTCGTGGCAACAGACGCTCTA720ATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACGTGCGTCACCCAG780ACAGTCGATTTCAGC79521<210>2<211>28<212>DNA<213〉人工合成〈220〉<223>HCVNS3上游引物〈400〉2GGAGGATCCCTAGAAACTACCACGCGGT28<210〉3<211>28〈212〉腿〈213〉人工合成〈220〉〈223〉HCVNS3下游引物〈400〉3GGGAAGCTTGCTGAAATCGACTGTCTGG28〈210>4〈211〉405〈212〉DNA〈213〉梅毒螺旋体(Treponemapallidum)<220>22〈223〉梅毒螺旋体17Kda蛋白的基因序列(TP17)〈400〉4TGTGTCTCGTGCATAACCGTGTGTCCGCACGCCGGGAAGGCCAAAGCGGAAAAGGTAGAG60TGCGCGTTGAAGGGAGGTATCTTTCGGGGTACGCTACCTGCGGCCGATTGCCCGGGAATC120GATACGACTGTGACGTTCAACGCGGATGGCACTGCGCAAAAGGTAGAGCTTGCCCTTGAG180AAGAAGTCGGCACCTTCTCCTCTTACGTATCGCGGTACGTGGATGGTACGTGAAGACGGA240ATTGTCGAACTCTCGCTTGTGTCCTCGGAGCAATCGAAGGCACCGCACGAGAAAGAGCTG300TACGAGCTGATAGACAGTAACTCCGTTCGCTACATGGGCGCTCCCGGCGCAGGAAAGCCT360TCAAAGGAGATGGCGCCGTTTTACGTGCTCAAAAAAACAAAGAAA405<210>5〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋体17Kda蛋白的上游引物〈400〉5GGGGGATCCTGTGTCTCGTGCATAACCG28〈210〉6<211>30〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋体17Kda蛋白的下游引物<400〉6GGGGAATTCTTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC30权利要求1.一种双抗原夹心免疫检测法，其特征在于反应体系中加有抗人IgG抗体。2.根据权利要求1的双抗原夹心免疫检测法，其特征在于抗人IgG抗体与待测样品有接触反应。3.根据权利要求2的双抗原夹心免疫检测法，其抗人IgG抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。4.根据权利要求2的双抗原夹心免疫检测法，其采用的标记物为酶。5.根据权利要求2的双抗原夹心免疫检测法，其采用的标记物为胶体金、胶体银、胶体硒、乳胶。6.根据权利要求2的双抗原夹心免疫检测法，其采用的标记物为化学发光物质、荧光物质、放射性物质。7.—种根据权利要求3、4制备的双抗原夹心法ELISA试剂盒，由多孔板、样品稀释液、酶结合物稀释液、显色液组成，其特征在于样品稀释液中含有抗人IgG抗体。8.—种根据权利要求3、5制备的双抗原夹心法试纸条，由PVC底板、加样垫、标记物垫、NC膜、吸水纸、对照线和检测线组成，其特征在于在加样垫或者标记物垫中含有抗人IgG抗体。全文摘要一种改良的双抗原夹心免疫检测法，其旨在降低现有双抗原夹心检测法的假阳率，提高检测的特异性。该方法通过将抗人IgG单克隆抗体或者多克隆抗体，以合适的使用比例加入到双抗原夹心法检测的反应体系之中参与检测，可具体应用于快速诊断、酶联免疫检测、化学发光检测等多种检测方法。本发明的双抗原夹心免疫检测法与现有双抗原夹心免疫检测法相比，检测的背景和假阳率有显著降低，特异性有大大提高。文档编号G01N33/577GK101498730SQ20091010605公开日2009年8月5日申请日期2009年3月16日优先权日2009年3月16日发明者婧孙,孙兴宝,亮彭,娟洪,潘少丽,王宁燕,王荣娥,鹏胡,颜文豪申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司