一种曲霉免疫优势抗原及用途的制作方法

专利名称：一种曲霉免疫优势抗原及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫诊断领域，涉及一种曲霉免疫优势抗原及用途。更具体而言，本发明涉及新鉴定的一种曲霉抗原，这些烟曲霉抗原能与侵袭性曲霉病病人血清中的特异性抗体发生强烈反应。通过基因重组技术，用原核细胞表达体系获得重组蛋白。本发明还涉及这种免疫优势抗原在侵袭性曲霉病血清学诊断中的用途。
背景技术：
侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，ΙΑ)属于感染性疾病，是一种严重的、 死亡率高的真菌感染。近年来，这种感染的发病率明显上升，成为血液病、器官移植、骨髓移植、艾滋病、自身免疫病等免疫功能低下的患者重要死因，也是重症监护病人、大手术后病人、导管留置病人的重要并发症。多种曲霉都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等，其中烟曲霉感染占曲霉病的90% [1]。在血液恶性肿瘤患者中，曲霉病的发生率为5-25%，在异体造血干细胞移植受者中发生率为8-15%，在实体器官移植受者中为5% -15%。由于抗生素的滥用及激素类药物的广泛使用，甚至在免疫功能正常者，侵袭性曲霉病发病率也在上升。侵袭性曲霉病患者的病死率高达30-80%，不治疗死亡率几乎达100%。研究表明，如果能够早期做出病原学诊断，在患者的临床症状还不十分严重时就开始抗曲霉治疗，则患者的存活率会提高到80% β]，因此早期诊断、早期治疗对提高侵袭性曲霉病患者的生存率具有重要意义。然而，侵袭性曲霉病的病原学诊断一直是临床上的难题。目前常用于真菌感染的诊断方法包括真菌显微镜检查和培养、组织病理学检查、血清学检测检测曲霉代谢产物、 以及特异性病原体基因检测，等等。但是目前已有的这些用于诊断侵袭性曲霉病的方法效果还不理想。临床标本真菌培养需要至少2周时间，且血培养的阳性率一般低于5% ω。我们曾用烟曲霉感染家兔，造成家兔弥散性烟曲霉感染模型，采集血样进行培养。结果证实， 虽然感染动物器官组织内有大量病灶，但血培养烟曲霉却阴性Μ。组织病理学的诊断需活检取材，对多数患者来说比较困难，可行性差；基因诊断方法检测DNA，对其他病原体而言， 具有快速、灵敏的特点，但由于曲霉胞壁厚实坚韧，DNA提取困难[5]，不易得到阳性结果 ’另一方面，由于空气中存在大量烟曲霉孢子，容易在实验操作中造成污染，导致假阳性结果的出现[6’7]；因此，到目前为止，测定曲霉DNA的PCR方法还未被临床实验室采用。近期研究证明，以测定真菌抗原、抗体和循环代谢产物为基础的血清学诊断方法潜力较大[8 11]。曲霉在体内发生侵袭性感染时，由孢子状态延伸生长成菌丝，此时向体液中释放菌丝蛋白，并刺激机体产生抗体。鉴于曲霉感染的这个特征，一般认为，血循环中抗原或特异抗体水平上升，预示着菌丝体延伸和/或曲霉感染的发展。由于曲霉蛋白质成分复杂，而且基础疾病、前期用药不同的病人其机体处于不同免疫状态，导致体内曲霉抗原、 抗体种类和量也有差别。因此，作为实验室诊断用的目标抗原和抗体，应该选择在不同免疫状态的的病人罹患侵袭性曲霉病时，在其体内优势大量表达、并能够强烈刺激人体产生抗体的曲霉蛋白质抗原组分。迄今，国内外对这些优势抗原组分的认识很少。
参考文献1.Bellocchio S, Bozza S, Montagnoli C, et al. Immunity to Aspergillus fumigatus :the basisfor immunotherapy and vaccination. Medical Mycology. 2005, 43 (Si) :S181-S1882. Caillot D,Casanovas O,Bernard A,et al. Improved management of invasive pulmonaryaspergillosis in neutropenic patients using early thoracic compted tomographic scan andsurgery. J clin oncol. 1997,15 (1) :139-147.3. Tarrand JJ, Lichterfeld M, Warraich I，et al. Diagnosis of invasive septate mold infections. Am J Clin Pathol. 2003,119(6) :854-858.4.周万青，李芳秋，王立魁，等.烟曲霉深部感染家兔模型的建立.现代检验医学杂志，2009，24 O) 86-885.周万青，李芳秋，王立魁，等.不同破壁方法提取真菌DNA的比较.临床检验杂志，2009，27 (3) :212-214.6. Hope WW, Denning Dff. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis.2005，5(10) :609-622.7. Viscoli C, Machetti M, Cappellano P, et al. False-positive galactomannan Plsteliaaspergillus test results for patients receiving piperacillin-tazobactam. Clin Infect Dis. 2004,38 (15) :913-9168. Pfeiffer CD, Fine JP, Safdar N. Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannanassay :a meta-analysis. Clin Infect Dis.2006,42 (10) 1417-14279. Khan ZU, Ahmad S, Theyyathel AM. Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA, (1-3)-b-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens ofexperimentalIy infected rats. Mycoses. 2008, 51(2) :129-13510.Einsele H, Loeffler J. Contribution of new diagnostic approaches to antifungal treatmentplans in high-risk haematology patients. Clin Microbiol Infect. 2008,14(S4) :37-45.11.李芳秋，周万青，史利宁，等.烟曲霉分泌蛋白抗体的ELISA检测及诊断价值评估.临床检验杂志，2010, ) =107-109

发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种能与侵袭性曲霉病病人血清中的特异性抗体发生强烈反应的曲霉免疫优势抗原。本发明另一个目的是提供上述曲霉免疫优势抗原的用途。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种曲霉免疫优势抗原，该抗原为曲霉硫氧还蛋白还原酶、果糖二磷酸醛缩酶、肌动蛋白细胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶中的一种或多种。所述的曲霉免疫优势抗原，该抗原为曲霉硫氧还蛋白还原酶。
一种曲霉免疫优势抗原，该抗原为上述曲霉硫氧还蛋白还原酶的基因重组蛋白即基因重组曲霉硫氧还蛋白还原酶。上述曲霉免疫优势抗原在制备侵袭性曲霉病的诊断试剂中的应用。一种侵袭性曲霉病的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述曲霉免疫优势抗原中的一种或多种。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述基因重组曲霉硫氧还蛋白还原酶。本发明利用具有代表性的侵袭性曲霉病病人血清中的特异性抗体，通过免疫蛋白质组学技术，对烟曲霉抗原成分进行识别，再通过生物信息学技术分析，筛选鉴定出四个不同优势抗原蛋白，包括硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase GliT)、果糖二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase, class II)、肌动蛋白细胞骨架蛋白 VIPl (actincytoskeleton protein(VIPl))、分泌型二肽基肽酶(secreted dip印tidy 1 peptidase DppV)。最后通过基因重组技术，用原核细胞表达体系获得一种重组蛋白。本发明还涉及这种曲霉免疫优势抗原在侵袭性曲霉病的诊断中的应用。进一步，本发明的技术方案首先筛选了多例病理组织学检查和真菌培养均证实为侵袭性曲霉病(IA)的确诊病人，并用烟曲霉抗原包被的ELISA法证实抗体为阳性。其次用 ELISA法和Wfestern blot法比较了烟曲霉菌体抗原和分泌抗原的免疫反应性，发现分泌蛋白与IA确诊病人血清的免疫反应性明显高于菌体抗原，而与正常对照血清的反应均为阴性。最后，对分泌蛋白进行二维电泳0-DE)分离，并与确诊IA病人血清进行免疫印迹，通过质谱分析和生物信息学技术鉴定有免疫反应的蛋白点，鉴定的一组新抗原即为本发明的烟曲霉免疫优势抗原。以下是本发明的具体技术措施1、选择一组共781例病人共1099份血清，其中8例是确诊为IA的病人，6例血清用于筛选鉴定新的免疫优势抗原。其他病例为临床诊断IA33例，拟诊IA 189例，排除IA 551例。以上所有血清标本用来考查新鉴定出的抗原作为血清学试剂检测病人标本的诊断效果；2、比较烟曲霉菌体抗原和分泌抗原的免疫反应性；3、对分泌蛋白进行二维电泳分离，并与确诊IA病人血清进行免疫印迹，通过质谱分析和生物信息学技术鉴定有免疫反应的蛋白点；4、从上述方法中鉴定出的新的抗原蛋白中，优选下列4个中的一个或多个，即硫氧还蛋白还原酶、果糖二磷酸醛缩酶、肌动蛋白细胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶为所述的烟曲霉免疫优势抗原。5、通过基因重组技术，克隆上述硫氧还蛋白还原酶蛋白质的基因，用原核细胞表达系统表达，获得重组蛋白。6、用上述重组蛋白抗原作为试剂，检测上述病人血清，考查在诊断侵袭性烟曲霉感染中的应用价值。本发明的有益效果本发明采用一种快捷有效地筛选烟曲霉免疫优势抗原的方法，并鉴定了一组新的烟曲霉抗免疫优势抗原。本发明新鉴定的烟曲霉优势抗原，能被多数侵袭性烟曲霉感染病人血清中特异性抗体识别。用上述反应最强的免疫优势抗原硫氧还蛋白还原酶蛋白的基因
5序列，制备出的基因重组抗原，用于检测侵袭性烟曲霉感染病人血清，取得理想结果，其诊断敏感性为48. 9 % 85. 1 %，特异性为83. 5 % 86. 9 %。


图1是烟曲霉抗原蛋白SDS-PAGE电泳以及与人血清的免疫印迹结果。其中=Lane1 菌体蛋白，Lane 2 分泌蛋白，Lane M 蛋白 Marker ；A =SDS-PAGE 电泳，B 与确诊IA病人血清的免疫印迹，C 与健康对照血清的免疫印迹。图2是6例确诊IA病人血清与曲霉分泌蛋白的免疫印迹结果。图3是曲霉分泌蛋白双向电泳以及与病人及健康人免疫印迹结果。其中A :2-DE银染图；B 与确诊病人的免疫印迹结果；C 与健康对照血清的免疫印迹结果。Lane M 蛋白Marker (在图3A左侧)。图4是硫氧还蛋白还原酶质谱鉴定图谱。图5是PCR和双酶切鉴定重组表达质粒pET28a(+) /GliT电泳图。其中Lanel :2000bp DNA marker ；Lane2 重组表达质粒；Lane3 重组表达质粒双酶切产物；Lane4 :PCR扩增产物。图6是重组表达质粒pET28a(+)/GliT在E. coli BL21中诱导表达。其中LaneM蛋白质 marker，Lanel :IPTG 诱导的 pEI^8a(+)/GliT 转化菌，Lane2 未加诱导剂的阳性克隆，Lane3纯化的重组蛋白。图7是烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白与确诊IA病人免疫印迹结果。其中LaneM 蛋白质marker，Lanel 6确诊IA病人血清，Lane7健康人血清对眧。另，图1、图3A、图6中marker数值均X IO30
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例一病人标本来源、诊断标准1.病人标本来源收集781例患者的1099份血清标本，分别来自南京及周边地区 26家医院的血液科、呼吸科、ICU病房、肿瘤科、肾脏病科、风湿免疫科。男484例，女297例， 年龄18-99岁。这些病人的基础疾病为恶性血液病如急慢性白血病、重型再障、恶性淋巴瘤等及造血干细胞移植术后230例，慢性肺病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支气管炎、 支气管扩张、肺结核及重症肺炎等247例，自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、类风湿性关节炎、干燥综合征等47例，肾脏病如肾病综合症、急慢性肾功能衰竭、急慢性肾炎等36例，恶性肿瘤如肺癌、食道癌、肝癌、肠癌等及术后35例，肝、肾、肺移植术后31例，其他疾病巧5例。所有血液样本均于采血Mh内分离出血清，-70°C保存。2.病人诊断标准参照欧洲癌症治疗组织及真菌病研究组(E0RTC/MSG)制定的诊断标准及中国侵袭性肺部真菌感染工作组制订的侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)，将诊断分为确诊、临床诊断、拟诊及排除IA。①确诊至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征，肺组织标本用组织病理学或细胞化学方法检出菌丝或球形体(非酵母菌的丝状真菌)，并发现伴有相应的肺组织损害。肺组织标本、胸液或血液霉菌培养阳性。②临床诊断至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征，合格痰液经直接镜检发现菌丝，二次培养出曲霉，或支气管肺泡灌洗液直接镜检发现菌丝或培养出曲霉。③拟诊至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征。④非IA组不满足上述诊断标准的患者。原发患者可无宿主因素。根据以上标准，781例患者中，确诊为IA 8例，临床诊断IA33例，拟诊IA 189例，排除IA 551例。 另收集200名正常人血清作为对照。3.病人分组根据患者的基础疾病及是否接受影响免疫功能的药物分三组，A组为恶性血液病及造血干细胞移植术后(HSCT)组(共230例，其中真菌感染92例)，B组为非恶性血液病及非HSCT但使用了影响免疫功能药物的患者组(共154例，其中真菌感染57 例)，C组为非恶性血液病及非HSCT且未使用影响免疫功能药物的患者组(共397例，其中真菌感染81例)。实施例二烟曲霉免疫优势抗原筛选方法1.菌株与培养条件烟曲霉Al为中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心保藏的标准菌株，保藏号为CMCC(F)Ala。真菌于沙堡氏琼脂培养基上培养，分生孢子悬于0. 9% NaCl (含0. 1 % Tween 80)，血球计数板计数。2.菌体蛋白和分泌蛋白的制备将2X IO7烟曲霉分生孢子分别接种于YEPG培养基，37°C 150rpm震荡培养若干天。取培养上清和菌丝用于制备真菌抗原。菌体蛋白的制备将培养物过滤，收集菌丝，PBS洗涤数次后，经液氮充分研磨，用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取蛋白；即50mg菌体蛋白中加入500μ 1 TCA/丙酮蛋白沉淀液(含13. 3% TCA和 0. 093%的β -巯基乙醇的丙酮)，_20°C放置2h，14000 Xg离心5分钟，沉淀用冰冷的丙酮洗3次，室温干燥30分钟后，溶于蛋白裂解液(7M尿素，2%SDQ。分泌蛋白的制备将培养物过滤，收集上清，加入4倍体积的TCA/丙酮沉淀液，其余操作步骤同菌体蛋白的提取。 Bradford法定量蛋白浓度，牛血清白蛋白为标准品。3.用烟曲霉分泌蛋白进行ELISA测定病人血清提取的烟曲霉分泌蛋白用包被液 (pH 9. 6碳酸盐缓冲液)稀释至lyg/ml，加入ELISA反应板，IOOyl/孔，4°C冰箱过夜。用
0.01mol/L PBS洗涤3次，1分钟/次，将上述病人781例血清做适当稀释(血清稀释液为含0. l%Tween-20和1 %小牛血清的PBS缓冲液)后，加入反应板，100 μ 1/孔，每个稀释度均设复孔，每板均设阳性、阴性和空白对照。37°C温育45分钟，同上洗涤。加1 10000稀释的HRP-兔抗人IgG，37°C温育45分钟，同上洗涤，加TMB-过氧化脲溶液，100 μ 1/孔，显
色15分钟，以2mol/L H2S0450 μ 1/孔终止反应，测定450nm处吸光度(A)。结果以[+2S即
1.03为临界值(cutoff值)，A > 1. 03为抗体水平升高。4.从全部病例中筛选6例经病理组织学和真菌培养确诊为侵袭性曲霉病(IA)的病人(表1)，并经ELISA法证实抗烟曲霉抗体水平升高的血清，用于免疫蛋白质组学分析。5.免疫印迹法比较烟曲霉菌体抗原和分泌抗原的免疫反应性 烟曲霉菌体蛋白和分泌蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，按0. 8mA/cm2胶经半干转印法转移到硝酸纤维膜上。浸入50g/L脱脂奶粉缓冲液中，在室温震摇状态下封闭1小时。将转印蛋白的硝酸纤维膜裁剪成条，分别与1 1000稀释的健康人血清以及6例确诊IA病人血清在4 °C反应过夜，PBS-T洗膜3次，每次10分钟。加入 HRP标记的羊抗人Ig G(1 2000) 37 °C 1小时，PBS-T洗膜3次，每次10分钟。加入
6. 二维电泳O-DE)分离烟曲霉分泌蛋白A.上样烟曲霉在YEPG基质中培养14天分泌蛋白150 μ g加入相应体积的IPG (固相PH梯度)Buffer以及水化液至终体积350 μ 1，平铺在胶条槽中，撕去Mcm IPG胶条的保护膜，将胶条凝胶面向下小心放入胶条槽中均勻覆盖上样液，在胶条上方加入适量凝胶条覆盖液后盖上胶槽盖(注意放入胶条时避免在胶条下产生气泡)。注水化液成份8M尿素，2% 3-[(3_胆酰胺丙基)_ 二乙胺]-丙磺酸，20mM 二硫苏糖醇0.5% (ν/ν)B.第一向等电聚焦设置IPGphor仪器运行参数①低电压水化，30v 6h ；60v 6h;②升压，500v Ih ； IOOOv Ih ；③等电聚焦，8000v约10h。待Mcm胶条等电聚焦达到 80000vhr,第一向等电聚焦结束。C.胶条的平衡取出刚刚等电聚焦完毕的IPG胶条，放入IOml含二硫苏糖醇(DTT) (w/v, g/ml)的胶条平衡缓冲液中，于摇床上轻微振荡平衡15分钟；后在IOml含 2.5% (w/v)碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液中，于摇床上轻微振荡15分钟。取出胶条，在SDS 电泳缓冲液中稍微清洗一下，滤纸吸干多余水分。D.第二向SDS-PAGE电泳配制12. 5 %的SDS聚丙烯酞胺分离凝胶，水饱和正丁醇封压，凝固后用电泳缓冲液冲洗胶面3次。将平衡好的IPG胶条小心地置于SDS-PAGE凝胶的顶端，轻轻排除气泡，使胶条与凝胶表面紧密接触。将蛋白Marker加于滤纸上，置于胶条的的酸性端。用低熔点琼脂封胶液凝固后，进行第二向电泳，先按每块胶IOmA电泳30分钟， 然后按每块胶20mA电泳直至溴酚蓝前沿到达凝胶底部时，终止电泳。7.免疫印迹A.半干转印将裁好的PVDF膜用甲醇浸泡后，两蒸水冲洗数次，于转膜缓冲液中摇 30分钟。依次铺好滤纸/凝胶/PVDF膜/滤纸，赶走气泡，确保没有短路，缓冲液用量适中。 180mA转印池。转印完成后，凝胶置于银染固定液中固定过夜；PVDF膜置于50g/L脱脂奶粉缓冲液，于摇床上室温封闭lh。B.免疫印迹封闭好的PVDF膜分别与多位健康人混合血清以及多位确诊IA病人混合血清(1 1000稀释)4°C反应过夜，PBS-T洗膜3次，每次10分钟。加入HRP标记的羊
ECL (enhancedchemiluminescence reagent,Amersham Biosciences) Il影液Il影。结果 病人血清的与分泌蛋白免疫反应性强于菌体蛋白(图1，B)，健康人血清与两种蛋白的反应很少(图1，C)。从图2可见，6例病人血清都与烟曲霉分泌蛋白免疫反应，大部分反应强的蛋白质分子量在30-55kDa之间。表16例确诊IA病人的基本特征抗人 IgG(l 2000 稀释)37°C lh，PBS-T 洗膜 3 次，每次 10 分钟。ECL(Amersham)显影。8.硝酸银染色A.固定将转印后的凝胶置于固定液中固定过夜(50ml冰醋酸，200ml无水乙醇， 加去离子水至500ml)。B.敏化固定结束后敏化30分钟(150ml无水乙醇，1. 57g硫代硫酸钠.5H20，34g 无水醋酸钠，加去离子水至500ml)。C.水洗500ml去离子水洗3次，5分钟/次。D.银染银染20分钟(硝酸银1.25g，加去离子水定容至500ml，临用前加甲醛 100 μ 1)。Ε.水洗500ml去离子水洗3次，5分钟/次。F.显色加入显色液显色至蛋白点显影满意，一般为5-10分钟(12. 5g无水碳酸钠，加去离子水定容至500ml，临用前加甲醛100 μ 1)。G.终止加入终止液终止10分钟(甘氨酸2g，加去离子水定容至500ml)。
H.保存10 %乙醇保存待用。9.图像扫描与分析染色后的双向电泳凝胶采用Imagekarmer扫描仪进行扫描， 数字化图像文件用Amersham Pharmaeia公司的ImageMaster 2D Platinum软件进行凝胶的数据分析。图像分析过程包括蛋白质点的检测、量化、背景扣除、点的匹配(Match)、 建立平均凝胶等。蛋白质点自动检测后，与免疫印迹图像匹配前，先选取一些匹配点 (seedmatches)，然后自动匹配其他蛋白质点。10.胶内酶切A.先将胶用去离子水洗10分钟，3次。B.用切胶专用移液器，直径1. 5mm的塑料吸头，从银染胶上将对应于免疫印迹阳性反应点的蛋白质点取下，尽可能将目的点取完整，共取出40个蛋白质点，放入预先编号
的96孔板中。
C.每孔加50 μ 1乙腈，室温脱水5分钟，吸去乙腈。
D.加50 μ 1 IOmM DTT，56°C还原Ih ；加碘乙酰胺避光常温放置45分钟。
E.用50 μ 1 25mM碳酸氢胺洗5分钟，加50 μ 1乙腈脱水，抽真空干燥。
F.每个胶粒加入2-3 μ 1 lOng/μ 1的胰酶溶液，37°C过夜。
G.力口 10 μ 1 2%三氟乙酸终止酶解反应。
11.MALDI-T0F质谱分析酶解样本上样，用已知肽混合物作为外标。用UltrafIexII
型培养基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-T0F)质谱仪(Bruker Daltonics，德国)上测定，电离模式为正离子模式，分辨率达15000-20000，质量准确度小于0. IDa0
12.数据库查询所得肽质量指纹谱(PMF)用FleXAnalySiS2.4软件处理。肽段检测算法为SNAP算法，信噪比(S/N)的阈值为3，质量因子的阈值为50，用胰蛋白酶 (porcinetrypsin, promega)的自角军片段(trypsin[108-115] ,842. 509 ；trypsin[58-77], 2211. 104)作为内标校准。用检索软件Mascot 2. 1. 03对检测得到的PMF图谱进行检索。 数据库选NCBhr，种属选烟曲霉，作用酶trypsin，1个误切，肽段分子量最大允许误差范围 lOOppm，氨基酸固定修饰方式选Carbamidomethyl(c)，可变修饰选Oxidation (M)，蛋白质整个序列覆盖率至少15%，至少有5个肽匹配。
二维电泳银染结果及免疫印迹的结果见图3。共取40个蛋白质点进行了质谱分析，成功鉴定了 39个免疫反应的蛋白质点，代表17种蛋白质，13种蛋白质的分子量在30-55kDa之间，与I-DE的结果相一致。在鉴定出的17种蛋白质中，有2个为已知抗原，15个为新发现的免疫原性蛋白，包括硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductaseGliT)、FTVD f衣赖型氧化还原8| (FAD dependent oxidoreductase, putative) > 延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase FahA)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenaseAldA)、芳香氨基转移酶(aromatic a otransferase Aro8)、果糖二磷酸酸缩酶(fructose-bisphosphate aldolase, class II)、G 蛋白复合体 β 亚基(G-protein comlpex betasubunit CpcB)、肌动蛋白细胞骨架蛋白 VIPl (actin cytoskeleton protein(VIPl))、phytanoyl_CoA二氧酶(phytanoyl-CoA dioxygenase family)、果胶酸裂合酶A(peCtate lyaseA)、尿酸盐氧化酶(urate oxydase UaZ)、3_羟丁酰辅酶A脱氢酶(3 -hydroxybutyryl-CoAdehydrogenase)、蛋白Sl体组分 Pre8 (proteasome component Pre8, putative)(aspartyl aminopeptidase)禾口一^^^^胃胃白(hypothetical protein)。这些蛋白质点的具体标注见图3，蛋白质详细信息见表2。且在新发现的免疫原性蛋白中，2号蛋白(共13个蛋白点)免疫反应最强，鉴定结果为硫氧还蛋白还原酶，其质谱鉴定图谱见图4。实施例三烟曲霉硫氧还蛋白还原酶基因克隆1.菌株、载体与工具酶烟曲霉Al标准株来自中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心，保藏号为CMCC(F)Ala。;pEI^8a(+)表达载体、PMD18-T克隆载体购自大连宝生物公司，宿主菌为E. coli JM109及E. coli BL21(DE3)；限制性内切酶Nde I及BamH I、T4 连接酶、质粒提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、切胶回收试剂盒均购自大连宝生物公司； Taq DNA polymerase、总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒均购自Promega公司。2.引物设计与合成根据Genbank上已报道的烟曲霉GliT编码序列，使用I^rimer 5软件设计一对特异性引物，并在引物的5'端加入限制性内切酶位点及若干保护碱基。上游引物5' -CACACATATGTCGATCGGCAAACTAC‘ (SEQ ID No. 1，划线处为 Nde I 酶切位点)， 下游引物5' -CGAATTCCTATAGCTCCTGATCGAGACG-3‘ (SEQ ID No. 2，划线处为 EcoRl 酶切位点)。引物由大连宝生物公司合成。3.烟曲霉总RNA的提取烟曲霉接种沙氏培养基于培养数天，收获孢子并接种 YEPG培养液于振荡培养2天。取湿重IOOmg烟曲霉菌丝，加Iml RNA提取试剂，加液氮研磨成细粉，再依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇等试剂，具体操作见提取试剂说明书。4.基因的扩增以烟曲霉总RNA为模板，用Promega公司的RT-PCR试剂盒进行 cDNA第一链的合成，操作按试剂盒说明书进行。反应体系及反应条件如下RNA 1.8μ1， oligo(dT) 15Primer 1· O μ 1，H2O 7. 2 μ 1，70°C 10 分钟，冰浴 5 分钟；然后加 MgCl24. O μ 1， 10 X RT-PCR buffer 2. O μ l，dNTP 2 μ l、Rnase 抑制剂 1· O μ 1，AMV 酶 1· O μ 1，室温放置 10 分钟，42°C 30s, 95°C 5分钟，冰浴5分钟。基因扩增的体系如下10XPCRbuffer 2. 5 μ 1、MgCl2L 5 μ 1、dNTP 0· 5 μ 1、烟曲霉GliT上下游引物各0.5 μ 1，Taq酶0.3μl、模板cDNAlμl、补无菌水至25μl.反应参数为95°C变性5分钟，以95°C变性45s、57°C退火45s、72°C延伸80s，进行30个循环，最后72°C延伸10分钟。结果增出约IOOObp的DNA片段，双酶切重组表达质粒pET28a(+)/GliT(按实施例三-6制备)的酶切产物也为IOOObp左右，与预期片段的大小相符。5.克隆载体的构建及鉴定10g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，纯化试剂盒回收目的片段，与PMD18-T载体连接，操作按试剂盒说明书进行。体系如下:pMD18-T1. 0 μ 1 (0. 03pmol)目的基因1· 6μ 1(0. 2pmol)反应液(含连接酶)5·0μ1双蒸水2. 4μ1反应体积共10 μ 1。16°C反应2小时以上。转化E. coli JM109感受态细胞。涂布含0. lg/L氨苄西林的LB培养基过夜，对长出的菌落进行菌落PCR，筛选阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取PCR阳性菌落接种LB培养液，37°C震荡培养过夜，提取质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。经过PCR和酶切鉴定的重组质粒，经DNA序列测定，与基因Bank注册的该蛋白质基因序列一致。6.表达载体的构建用Nde I和EcoR I双酶切重组质粒pMD18_T/GliT，总反应体积为100 μ 1，琼脂糖凝胶电泳后，切下含目的基因的凝胶，按Takara试剂盒说明书回收目的基因，测定DNA液的浓度。按试剂盒说明提取质粒pET28a(+)，Nde I和EcoR I双酶切， 总反应体积为100μ 1，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，操作步骤同上。取纯化后的酶切载体与目的基因连接。连接体系如下目的 DNA 3. 0μ 1pET28a 1. 2μ 1buffer Ι.ΟμΙT4Ligase 0. 5 μ 1无菌水 4. 3μ 116°C连接过夜，转化Ε. coli BL21(DE3)感受态细胞。0. lg/L卡那霉素抗性筛选质粒转化阳性克隆，用菌落PCR和双酶切来鉴定重组表达质粒(见图5)。将构建成功的重组表达质粒命名为pET28a(+)/GliT0实施例四硫氧还蛋白还原酶基因的原核细胞表达和纯化将含有重组表达质粒的大肠杆菌，接种于含卡那霉素(0. lg/L)的LB液体培养基中，37°C 200r/分钟振摇培养过夜。次日以1 50稀释转种于含卡那霉素(0. lg/L)的LB培养液中，37°C 200rpm振荡培养。当菌液A6tltl 0. 6时，取出ImL菌液不加诱导剂作为阴性对照，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L，37°C诱导培养证。同时用含pET28a (+) 空载质粒的BL21菌作为空白对照。取ImL菌液，5000rpm离心5分钟，弃上清，50. 0 μ 1 1 X SDS凝胶上样缓冲液充分重悬菌体，隔水煮沸5分钟，12000rpm离心5分钟，取8 μ 1上清进行SDS-PAGE (浓缩胶50g/L,分离胶120g/L)，考马斯亮蓝R-250染色(图3，lane 1， 2)。同上诱导重组融合蛋白表达。收集菌体并进行超声破碎处理，4°C 12000Xg离心20分钟。按照TALON金属亲和层析柱说明书纯化超声裂解上清中的重组蛋白，用含有150mmol/ L咪唑的洗脱液洗脱，4°C平衡缓冲液透析除去咪唑。SDS-PAGE分析纯化效果，Bradford法进行蛋白质定量(见图6，lane 3)。实施例五烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白抗原性分析烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白免疫印迹鉴定蛋白样本经SDS-PAGE电泳分离
11后，转膜。将转印重组蛋白的硝酸纤维素膜用50g/L脱脂奶粉的PBS-T封闭过夜，PBS-T漂洗3次，分别与6名确诊IA病人血清以及健康人血清(所有血清作1 1000稀释)4°C反应过夜，PBS-T洗膜3次，每次10分钟。加入HRP标记的羊抗人Ig G(1 2000) 37°C lh, PBS-T洗膜3次，每次10分钟。加入ECL显影液显影。结果示6例确诊病人血清与重组蛋白的免疫印迹结果显示强反应，而健康对照血清几乎不与重组蛋白反应(见图7)。实施例六硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在测定病人血清抗体中的应用以重组蛋白为包被抗原，用间接ELISA法测定IgG类特异抗体。用方阵滴定法选择最佳反应条件。抗原用pH9. 6,0. lmol/L NaHCO3稀释，以0. 1 μ g/孔包被聚苯乙烯反应板，4°C过夜。次日每孔加封闭液(含5. Og/L牛血清白蛋白、0. 28/1^鄉3的包被液)10(^1， 370C lh。用PBS-T洗3次，每次3分钟；将待测血清用含10%小牛血清的PBS作系列稀释， 加入微孔反应板100 μ 1/孔，每一稀释度均设复孔，37°C温育45分钟；PBS-T洗3次，每次 3分钟；加HRP标记羊抗人IgG抗体，370C 45分钟；PBS-T洗3次，每次3分钟；加入底物液 TMB-H2O2 显色，37°C 15 分钟，加终止液(2mol/L H2SO4) 50 μ 1/孔，于酶联仪(Bio-Rad MAel 680型)上测450nm波长吸光度(A)。结果以 +兀即0. 6为临界值(cutoff值)，A > 0. 6 为抗体水平升高。以值A > 0. 6为阳性标准，各组病人诊断的的敏感性、特异性见表3。表3不同患者组中抗体检测的敏感性、特异性
权利要求
1.一种曲霉免疫优势抗原，该抗原为曲霉硫氧还蛋白还原酶、果糖二磷酸醛缩酶、肌动蛋白细胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的曲霉免疫优势抗原，其特征在于该抗原为曲霉硫氧还蛋白还原酶。
3.一种曲霉免疫优势抗原，该抗原为权利要求2所述曲霉硫氧还蛋白还原酶的基因重组蛋白。
4.权利要求1、2或3所述曲霉免疫优势抗原在制备侵袭性曲霉病的诊断试剂中的应用。
5.侵袭性曲霉病的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1、2或3所述曲霉免疫优势抗原。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求3所述的曲霉免疫优势抗原。
全文摘要
本发明属于免疫诊断领域，公开了一种曲霉免疫优势抗原及用途。该抗原为曲霉硫氧还蛋白还原酶、果糖二磷酸醛缩酶、肌动蛋白细胞骨架蛋白V1P1、分泌型二肽基肽酶中的一种或多种。该曲霉免疫优势抗原能与侵袭性曲霉病病人血清中的特异性抗体发生强烈反应，可用于制备侵袭性曲霉病的诊断试剂。
文档编号G01N33/569GK102174485SQ20111004072
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月18日 优先权日2011年2月18日
发明者史利宁, 李芳秋 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院