专利名称：马疫锥虫抗原片检测试剂及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫诊断领域，涉及系统性红斑狼疮(SLE)的临床诊断，更具体地说，涉及马疫锥虫抗原片，及其制备以及应用该检测试剂临床检测SLE的高度特异性抗体抗双链脱氧核糖核酸(ds-DNA)抗体的存在。
抗双链脱氧核糖核酸(ds-DNA)抗体是SLE高度特异抗体，在其它情况下很少能检测到，并与SLE疾病活动性密切相关，被公认为诊断SLE的指标之一。抗ds-DNA抗体不仅对于SLE的诊断和鉴别诊断有重要意义，而且对于监视治疗和病情追踪以及判定预后等亦有重要意义。间接免疫荧光法(IIF)为目前临床常规检测抗ds-DNA抗体最常用的方法。1964年Beck等证明锥虫类(单细胞)的核和动基体为纯ds-DNA，不含组蛋白等其它成份。1975年Aarden等报告用短膜虫(Crithidia Lucilia,CL)培养片，1978年Konice等报告采用感染马疫锥虫(Trypaonsoma Epuiperdum,TE)的大鼠血涂片作为抗原底物，采用IIF法测定抗ds-DNA抗体。
抗DNA抗体可大体分为与天然(双链)DNA反应的抗体和与变性(单链)DNA反应的抗体两种。
抗双链DNA(ds-DNA)抗体主要见于SLE，阳性率在40％左右，以上为活动期患者，而在非SLE患者和正常人则多为阴性。有时其它结缔组织病患者抗ds-DNA也可为阳性，如干燥综合征(SS)、药物性狼疮(DIL)、混合性结缔组织病(MCTD)等，但阳性率低，一般＜1O％，抗体滴度也较低，且此类病人一般认为是SLE重叠综合征。由于抗ds-DNA抗体对SLE具有高度特异性，因此是目前公认的SLE血清特异性抗体，被列为SLE诊断标准之一。抗ds-DNA抗体在SLE的发病机理中起重要作用SLE并发的肾炎(狼疮性肾炎)是由抗DNA抗体介导的一种免疫复合物病。抗ds-DNA抗体亦可形成多种冷沉淀而致血管炎。该抗体的存在易引起SLE肾炎和典型的蝶形红斑。抗ds-DNA抗体与SLE疾病活动性关系密切，其抗体滴度多与SLE疾病的活动性而升降，活动期增高，缓解期降低甚至转阴。因此，抗ds-DNA抗体对SLE疾病活动期的判断和药物疗效观察很有帮助。
抗单链DNA(SS-DNA)抗体双链DNA变性时，双链断开即成单链DNA(SS-DNA)。抗SS-DNA可存在于多种自身免疫性疾病中，包括SLE、DIL、MCTD、SS、PSS(硬皮病)、PM/DM(皮肌炎或多发性肌炎)；也可存在于一些非自身免疫性疾病，如慢性活动性肝炎、细菌和病毒感染。因此，抗SS-DNA抗体对疾病诊断缺乏特异性，在临床上无实用价值。
抗ds-DNA抗体的检测方法很多，目前临床常规检测广泛应用的方法有间接免疫荧光法(IIF)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
IIF可分为马疫锥虫法(TE-IIF)和短膜虫法(CL-IIF)两种。是目前国内外临床常规检测抗ds-DNA抗体最常用的方法。IIF法具有特异性强、敏感性高、结果可靠、重复性好等优点；此外，该法实验要求的条件低、操做简便、价格便宜、易于推广。有关资料显示IIF法和Farr法比较，两者符合率达90％，IIF法敏感性略逊于Farr法，但特异性高，无假阳性反应；TE-IIF法和CL-IIF法两者符合率为88.70％；TE-IIF法在检测抗ds-DNA抗体同时，可利用抗原基质片中鼠白细胞检测ANA，发现测得结果与常规的鼠肝冰冻切片法的结果有良好的可比性(r=0.9265,p＜0.01)两者核型和滴度基本相符。IIF法存在的问题是抗原基质片制备困难。马疫锥虫法需在小鼠传代。使用不便；短膜虫法需培养及虫和传代保存，长期长传代，操作不当，易于污染。另有文献报告CL动基体含组蛋白，可与待测血清中抗组蛋白抗体交叉反应而致假阳性。
RIA(Farr法)Farr法测定的重复性好，可定量，敏感性较IIF法略高，但特异性差，需仪器设备，要求的实验室条件较高，并存在同位素污染及假阳性问题。Farr法则定抗ds-DNA抗体，在7％的正常人中呈假阳性反应，并在非SLE的结缔组织病中也呈低滴度的阳性反应，这可能与国内生产的检测药盒中的抗原ds-DNA不够纯有关。文献报告Ids-DNA中含ss-DNA 1％引起的假阳性就达6％。此外标记ds-DNA有时与非抗体蛋白[低密度脂蛋白和(或)补体成份]结合，亦可引起假阳性结果。
ELLSA不需特殊设备(同位素测定仪，荧光显微镜等)，但操作繁锁，较IIF未见有更多的优点。ELISA法中存在的主要问题是，同Farr法一样，如人工纯化的ds-DNA抗原不纯，易引起假阳性反应；此外DNA抗原不易吸附于固相载体上，即ds-DNA抗原包被困难。采取预包被措施易引入产生非特异反应的物质或造成ds-DNA变性、解链。以上结果都可致假阳性结果，影响该法特异性。附表IIF法和Farr法检测抗ds-DNA抗体比较(北京协和医院资料)IE-IIF法 CL-IIF法 Farr法SLE 51.2％ 46.9％62.0％SLE活动期 100％93.6％67.7％SLE非活动期 9.5％3.0％ 29.1％结缔组织病(非SLE) 3.0％2.7％ 20.2％
非结缔组织病01.8％12.9％正常人 007.0％本发明的目的之一是研制检测抗ds-DNA抗体检测试剂马疫锥虫抗原片。
本发明的另一目的是提供了利用马疫锥虫抗原(TE)体检测抗ds-DNA，为SLE疾病的诊断提供重要指标。
本发明是如下所述实现的马疫锥虫抗原片制备1、马疫锥虫繁殖将马疫锥虫菌株从液氮中取出，溶化后将其接种于小鼠腹部皮下，感染2-4日，从小白鼠尾部取血置玻片上，显微镜下观察，高倍镜下每视野达30-40条马疫锥虫时即可制片。
2、马疫锥虫抗原片制备从感染的小白鼠眼眶部取血。加入添加适量抗凝剂的玻璃试管中，用毛细玻璃管取血，在玻片上涂成直径0.5cm×0.5cm大小圆点，每张片涂十孔，自然晾干，加入干燥剂置锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置-20℃冰箱中保存待用。
3、马疫锥虫抗原片鉴定A、DNA抑制试验将已知强阳性反应的病人血清与双链DNA(小牛胸腺DNA、按0.1-0.3mg/ml不同浓度配制)相互作用30-45分钟，然后用该血清作用底物，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时用该病人的阳性血清对照。
B、RNA抑制试验将已知强阳性血清与RNA(1mg/mL)相互作用30-45分钟，然后用该血清作用底物，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。
C、DNA酶消化试验将DNA酶(0.1mG/ml)与抗原底物分别作用1、2、4、6小时，然后洗去DNA酶，再加已知的强阳性血清，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。
D、RNA酶消化试验将RNA酶(1mg/ml,0.5mg/ml不同浓度)与底物分别作用1、2、4、6小时，然后洗去RNA酶，再加已知的强阳性血清，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。
E、对照试验
用DNA阳性血清和DNA阴性血清分别加在已制备好了的抗原片上，反应30分钟后，加羊或兔抗人IgG荧光标记抗体再反应30分钟后，荧光显微镜下观察结果，阳性血清下的马疫锥虫动基体和核均有特异性荧光染色，阴性血清则无特异性荧光。
二、TE抗原片检测ds-DNA抗体马疫锥虫(TE)是一种致马类性病(马媾疫)的锥虫，对人类和其它家畜无致病作用。TE的核(Nuclear)和动基体(Kinetoplast)为不含组蛋白亦无单链DNA的纯ds-DNA抗原，抗原性纯一、特异，不需要复杂的分离提纯，故为检测抗ds-DNA抗体具有高度特异性的天然底物。采用感染TE的小鼠血涂片作抗原底物，IIT法检测抗ds-DNA抗体，阳性时可见到TE核及动基体发出特异性荧光。阴性时TE核及动基体均不发荧光，但虫体轮子廓隐约可见。
TE抗原片中含有鼠血中的白细胞，IIF检测抗ds-DNA抗体的同时，亦可检测抗核抗体(ANA)。阳性结果核型观察略逊于鼠肝冰冻切片法，但也可用做ANA定性过筛检测。
(一)操作1、将TE抗原片从铝箔包装袋取出后立即用电风扇吹干。将抗原片置蒸馏水中30秒-1分钟，溶解掉鼠血中红细胞，待干。
2、将被检血清用0.01mol/L pH7.4 PBS 1∶5稀释后，滴加于抗原上。
3、置湿盒37℃温育30分钟。
4、继用同一PBS摇床上洗涤三次，每次5分钟。
5、风干后滴加最适工作浓度羊或兔抗人IgG荧光标记抗体于抗原模上。同上法温育、洗涤、风干。
6、用PH7.4缓冲甘油封片，最后用荧光显微镜观察结果。
(二)结果1、抗ds-DNA抗体阳性TE核及动基体发出亮绿色特异性荧光。TE核较大，动基体较小，成对出现，较易辨认。核和动基体之间及周边有虫体轮廓隐约可见。对于抗ds-DNA抗体阳性血清，可用PBS做倍比稀释再进行检测抗体滴度。以能显示TE动基体荧光的最高稀释度为抗体滴度。
2、抗ds-DNA抗体阴性TE和动基体均不发荧光，但虫体轮廓隐约可见。
3、ANA阳性TE抗原片中鼠血白细胞发出亮绿色特异性荧光，而且可分辨不同的核型，与鼠肝冰冻切片法所见酷似。两者核型和抗体滴度基本相符。
(三)注意事项1、每次实验应设阳性对照和阴性对照。
2、TE抗原片置-20℃保存，有效期至少一年，应避免反复冻融。短期内使用可置4℃冰箱保存。
3、TE-IIF检测抗ds-DNA抗体，阳性时TE核和动基体应同时发特异性荧光。如出现TE核或动基件单独发特异性荧光这两种少见情况，报告结果时应慎重，应结合ANA、放免法(Farr氏法)实验结果及临床表现报告，如相符合(ANA阳性多为均质型、Farr氏法结合率＞20％)亦可报告为TE-IIF阳性否则应复查，查找实验原因。PBS偏酸时可出现此种假阳性反应，还应排除荧光抗体稀释度不适造成的非特异性荧光干扰。
(四)临床意义抗ds-DNA抗体是SLE的高度特异性抗体，是SLE诊断指标之一。活动期SLE，特别是肾型活动SLE抗ds-DNA抗体为100％阳性，非肾型活动期SLE患者抗ds-DNA抗体阳性率80％左右；而非活动期SLE病人，抗ds-DNA抗体阳性率30％以下。其它结缔组织病则阳性率很低(＜10％)。抗ds-DNA抗体滴度的升降与SLE疾病的活动程度相关。因此，抗ds-DNA抗体检测可监示SLE病情变化、疗效等。
本发明建立的TE-IIF检测抗ds-DNA抗体的方法，特异性强，重复性好，结果稳定可靠，方法要求条件低，操作简便易于推广。本发明制备的TE抗原基质片技术方法稳定，抗原片质量稳定可靠，使用方便。
如下图1应用马疫锥虫抗原片检测抗dsDNA抗体阳性(低倍镜)；图2应用马疫锥虫抗原片检测抗dsDNA抗体阳(高倍镜)。
权利要求
1.一种抗ds-DNA检测试剂马疫锥虫抗原片其特征在于由下列步骤制备的A．马疫锥虫的繁殖；B．制备马疫锥虫抗原片。
2.根据权利要求1所述的抗原片，其中步骤A包括将马疫锥虫菌株接种于小白鼠腹部皮下，感染2-4日后，从小白鼠尾部取血置玻片上，显微镜下观察，高倍镜下每视野达30-40条马疫锥虫时即可使用。
3.根据权利要求1或2所述的抗原片，其中步骤B包括从感染的小白鼠眼眶部取血，加入到添加了抗凝剂的试管中，用毛细血管从中取血，在玻片上涂成圆点，自然晾干，加入有干燥剂的锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置于-20℃冰箱中保存待用。
4.一种抗ds-DNA的检测方法，其特征在于将被检血清滴加于权利要求1所述的抗原片试剂的抗原孔上，37℃温育30分钟，用PBS摇体洗涤三次，每次5分钟，风干后滴加羊或兔抗人IgG荧光标记抗体于抗原片上，同上法温度、洗涤、风干，用PH7.4缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。
全文摘要
抗双链脱氧核糖核酸(ds－DNA)抗体是系统性红斑狼疮(SLE)高度特异性抗体,并与SLE疾病活动性密切相关。本发明研制了检测抗ds－DNA抗体检测试剂马疫锥虫(TE)抗原片,以及利用该试剂建立了间接免疫荧光法(TE－ⅡF)检测抗ds－DNA抗体的方法,该方法特异性强,重复性好,结果稳定可靠。
文档编号G01N33/558GK1312470SQ01109088
公开日2001年9月12日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者王慧珍, 李永哲, 崔京涛 申请人:王慧珍, 李永哲, 崔京涛