增强hpv抗原表位肽免疫原性的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法及类 病毒颗粒、颗粒制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病 毒属，它是一类分子量较小的无包膜的双链环状嗜上皮性DNA病毒，通过入侵生殖道鳞状 上皮细胞以及其他组织器官的上皮细胞，使细胞发生分化失调，引起局部上皮增生、增厚或 呈乳头状。
[0003] HPV基因组是双链环状DNA，以共价闭合的超螺旋结构、开放的环状结构、线性分 子3种形式存在，HPV基因组编码9个开放阅读框，分为3个功能区即早期转录区、晚期转 录区和非转录区。早期转录区又称为E区，分别编码El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8等8个 早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能。晚期转录区编码主要 衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPV衣壳是由72个L1蛋白五聚体构成的T= 7的二十 面体结构，因此一个病毒粒子上含有360个L1蛋白单体，L2蛋白位于L1构成的VLP(类病 毒颗粒）上，每个病毒粒子上含有12个或者更多拷贝的L2蛋白。
[0004] HPV的L1可以在酵母菌或者昆虫细胞中表达，并自我组装成与真正病毒颗粒大小 相同的VLP，也可以与L2蛋白共组装成VLP，VLP从形态学和抗原的荧光分析跟天然的病毒 几乎完全相同，并表现出了很好的免疫原性及耐受性，免疫机体后可诱导产生高滴度的中 和抗体，利用此方法可以生产HPVL1VLP疫苗。
[0005] 最为成熟的HPV疫苗是针对L1抗原设计的，代表产品为已获批上市的由Merck公 司生产的Gardasil包括HPV6、11、16、18 的四价疫苗，和GSK的CervarixHPV16、18 二 价疫苗，此外Merck开发的9价HPV疫苗已经完成了III期临床研宄，结果表明，对HPV-31、 33、45、52、58引起的宫颈、阴道和外阴癌前病变的保护性大约有97%，而对HPV-6、11、16、 18的免疫应答也不亚于Gardasil，预计9价疫苗也可以很快获批上市。
[0006] 虽然有多篇文章报道HPV的L2具有免疫原性，可以激发机体产生中和抗体，但是 针对HPVL2的预防性疫苗的研宄进展不大，部分原因与单独蛋白表达HPVL2的中和表位， 不能有效激发机体的免疫原因有关。
[0007] 1999年，Kawana等首先报道在HPV16L2aal08-120存在HPV6的交叉中和表位， 该表位的合成肽免疫的鼠血清能够同时抑制HPV16假病毒和HPV6假病毒的感染。Embers 等从体内水平上验证了该交叉中和表位的合成肽能够诱导中和性抗体，并抑制乳头瘤病毒 的感染。2007年，Gambhira等发现HPV16L2aal7 - 36多肽免疫的鼠血清能够中和HPV5、 HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52、HPV58 假病毒。现已证实L2 存在多个交 叉中和表位，将具有交叉中和活性的肽段序列链接在一起，可提高L2交叉中和表位的呈递 效率，是极具潜力的广谱性HPV疫苗研发途径之一，但唯一的遗憾是，纯粹的肽段偶联分子 量太小，不能有效激发机体的免疫反应。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于提供增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法。
[0009] 本发明所要解决的另一技术问题在于利用所述增强HPV抗原表位肽免疫原性的 方法获得可以展示人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒。
[0010] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述类病毒颗粒的制备方法。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述类病毒颗粒的应用。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0013] 一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，把HPV抗原基因组装到HBc(乙肝病毒 携带的蛋白，也是乙肝病毒的核心抗原）的基因上，体外表达融合蛋白，则整合之后的基因 通过外源表达使HBc形成VLP(类病毒颗粒），且所述VLP表面展示多个拷贝的HPV抗原， 得到HBc-HPVVLP。
[0014] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因为HPV晚期 转录区编码主要衣壳蛋白L1或HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
[0015] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因为HPV晚期 转录区编码次要衣壳蛋白L2。
[0016] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表达的HPV抗原 是L1或L2的一个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽的偶联。
[0017] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表达的HPV抗原 是L2的两个抗原肽的偶联，所述两个抗原肽的序列为ASATQLYKTCKQAGTCProilPKVEGKTIAD QILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPT。
[0018] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原肽完全暴露在 HBc形成的类病毒颗粒的表面，且VLP表面展示的HPV抗原肽多于一个拷贝。
[0019] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，可以在HBc基因上插入更多的 外源基因，且不影响HBc类病毒颗粒的形成。
[0020] 上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得可以表达人乳头瘤病毒抗原肽的 类病毒颗粒，为HBc-L2融合蛋白，具有序列表中〈400>8所示的序列，即实施例中表1中的 全基因组序列。
[0021] 优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得可以展示人乳头瘤病毒抗 原肽的类病毒颗粒，所述HBC-L2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达后可自组装 VLP〇
[0022] 上述类病毒颗粒的表达载体构建方法，具体步骤为：
[0023] (1)克隆载体转化DH5a，挑取单克隆，接种于5mlLB培养基中，37°C200rpm过夜 培养；
[0024] (2)按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒提取效 果；
[0025] (3)BamHI和Ndel双酶切克隆载体上的目标基因；
[0026] (4)按照胶回收试剂盒说明书回收目标基因；
[0027] (5)将回收的目标基因和经BamHI和Ndel双酶切后的表达载体质粒pET9a通过连 接酶进行连接，16 °C过夜；
[0028](6)连接产物转化BL21 (DE3)，挑取单克隆进行PCR鉴定，继而将阳性克隆接种LB 培养基后提取质粒进行酶切鉴定；
[0029] (7)阳性菌种扩增保存。
[0030] 所述步骤（1)所述克隆载体由lifetechnology公司构建，外包公司合成目标基 因（_包括两端的BamHI和Ndel酶切位点）并连接T载体构成克隆载体。
[0031] 优选的，上述类病毒颗粒的制备方法，所述HBc-HPVVLP的表达和纯化的具体步骤 为：
[0032]I、表达实验步骤为：
[0033] (1)菌种复苏：将10ul冻存菌液接种到50mlLB培养基中，37°C，250rpm摇菌过 夜；
[0034] (2)菌种扩增：以5ml复苏菌液接种lOOmlLB培养基的比例扩大培养，2L三角瓶中 加入 1L的LB培养基，37°C250rpm摇菌至 0D600 = 0? 60. 7 ；
[0035] (3)诱导表达：加入IPTG诱导目标蛋白表达，其中诱导条件为ImMIPTG，25°C低温 诱导；
[0036] (4)菌体收获：诱导4h后，诱导结束，8000rpm离心10min，收集菌体沉淀；
[0037] (5)超声破碎：菌体用 400mLTGEbuffer(50mMTris，0. 5mMEDTA，50mMNacl，5% 甘油）重悬，冰浴超声破碎，镜检确保菌体完全破碎；
[0038] II、纯化的实验步骤为：
[0039] (1)蛋白收集：超声破碎后，8000rpm离心10min，收集上清；
[0040] (2)蛋白沉淀：蛋白上清在磁力搅拌状态下缓慢加入（NH4)2S04粉末，终浓度为 10%w/v，待所有粉末溶解后将烧杯置于4°C静置2h;
[0041] (3)离心收集沉淀，计算沉淀重量，以每lg沉淀用60mLbuffer的比例以TGE buffer重悬溶解；
[0042] (4)重悬液再次离心，收集上清，过0. 22ym滤膜；
[0043] (5)膜包洗涤：100KDa的膜包反复洗滤，其目的是除去小分子量蛋白质，同时浓缩 重悬液体