积，洗滤结束后浓缩体积至l〇ml左右，过0. 22ym滤膜；
[0044] (6)CL-4B凝胶分离纯化浓缩液，收集第一峰；
[0045] (7)采用分子筛高效液相色谱（SEC-HPLC)以及HPLC-多角度激光光散射（MALS) 联用技术鉴定蛋白纯度和VLP颗粒大小。
[0046] 上述类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用。
[0047] 优选的，上述类病毒颗粒在制备不含有任何佐剂和保护剂的HPV液体针剂疫苗方 面的应用，具体步骤如下：
[0048](1)缓冲液置换：将疫苗原液的缓冲液置换为20mg/ml的NaCl，或者4mM的PB或 者8mg/ml的NaCl+2mM的PB(2)，测定蛋白浓度，浓度测定方法参考蛋白浓度测定试剂盒说 明书；
[0049] (3)补加相应的缓冲液至抗原浓度为100ug/ml，或者50ug/ml;
[0050](4)无菌过滤，得到疫苗半成品；
[0051] (5)自动分装机分装疫苗半成品，0? 5ml/剂；
[0052] (6)封口，如果疫苗产品分装在安剖瓶中的话，需要封口，如果分装在西林瓶中的 话，需要压盖；
[0053] (7)贴签，4°C冷冻保存。
[0054] 优选的，上述类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用，其中疫苗终产品包括氢氧 化铝佐剂，具体的步骤如下：
[0055] (1)缓冲液置换：将疫苗原液的缓冲液置换为20mg/ml的NaCl，或者4mM的PB或 者8mg/ml的NaCl+2mM的PB(2)，测定蛋白浓度，浓度测定方法参考蛋白浓度测定试剂盒说 明书；
[0056] (3)补加相应的缓冲液至抗原浓度为900ug/ml，或者450ug/ml;
[0057] (4)无菌过滤，得到疫苗半成品；
[0058](5)加入1 %的氢氧化铝佐剂，补加缓冲液使得佐剂的终浓度< 0. 1 %，蛋白抗原 的终浓度为 100ug/ml，50ug/ml;
[0059] (5)自动分装机分装疫苗半成品，0. 5ml/剂；
[0060] (6)封口，如果疫苗产品分装在安剖瓶中的话，需要封口，如果分装在西林瓶中的 话，需要压盖；
[0061] (7)贴签，4 °C冷冻保存。
[0062] 本发明的有益效果是：
[0063] 上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，克服了现有技术抗原肽免疫原性差的 缺点，克服了插入序列对HBcVLP组装的影响，合理设计了L2抗原肽在HBc中的插入位点， 使HBc-VLP表面覆盖着不仅一个拷贝数的L2抗原肽，即本系统在假病毒的外表面，可以呈 递不仅一个拷贝数的L2抗原肽，使HPVL2中和表位完全被HBc假病毒颗粒展现在病毒粒 子表面，从而有效的增强L2中和表位多肽的免疫原性；所得HBC-L2融合蛋白可溶表达后可 自动组装为VLP，免除了体外蛋白以变性复性形成VLP的繁琐过程，极大的提高了抗原VLP 的回收率；所得HBC-L2融合蛋白在预防HPV感染的疫苗生产方面具有重要应用。
【附图说明】
[0064] 图1 :HBc-L2-pET9a表达载体酶切图，图中显示酶切得到670bp左右的DNA片段， 和融合基因的理论大小相一致；
[0065] 图2 :HBc_L2诱导表达鉴定，图中显示IPTG诱导表达结束后，离心收集菌体，超声 破碎后上清和沉淀电泳，结果表明，目标蛋白主要分别在上清中，说明构建的融合基因主要 以可溶表达的形成表达目标蛋白；
[0066] 图3 :HPLC鉴定HBC-L2VLP，图中显示实验设计的HPVL2融合多肽只有52个氨基 酸，理论上分子量约22KD，但是经SEC-HPLC分析（使用TSKG5000)，获得的纯化产物的分 子量（保留时间14min)远远大于BSA的蛋白（分子量66KD，保留时间大约在23min)，提示 融合蛋白自组装形成VLP颗粒；
[0067] 图4 :MALS鉴定HBC-L2VLP，图中显示结合SEC-HPLC以及MALS结果可以看出，表 达产物中存在分子量均一性好的大分子颗粒；
[0068]图5 :HBc_L2VLP电镜照片，图中显示电镜图片直观显示融合蛋白成功自组装为 VLP，和SEC-HPLC以及MALS的结果相一致；此外，从电镜图片中可以看出，融合蛋白自组装VLP颗粒的效率高，VLP颗粒均一性好；
[0069] 图6 :CL-4B分离100KD膜包超滤液纯化图，图中显示lOOKDa超滤浓缩液，经CL-4B 可以有效的分离得到VLP，图中箭头峰则为CL-4B分离得到的融合蛋白VLP颗粒；
[0070] 图7 :HBc-L2VLP颗粒纯度分析（HPLC)，图中显示VLP纯化抗原SEC-HPLC纯度分 析结果，图中箭头所指目标峰的纯度达到85% ;
[0071] 图8:乙肝病毒HBc蛋白VLP组装图，图中显示乙肝病毒（HBV)的HBc蛋白在大肠 杆菌表达后，可以自动组装成VLP颗粒；
[0072] 图9 :HBc_L2VLP疫苗设计模拟图，图中显示HBc蛋白的前段，后端以及中间可以插 入外源抗原，且不影响VLP的形成，更重要的是插入抗原经HBc蛋白VLP组装后，全部展示 于外面。
【具体实施方式】
[0073] 实施例1HBC-L2VLP重组融合蛋白的构建
[0074] (l)HBc_L2基因序列的合成
[0075] 外包Lifetechnology合成HBc_L2融合基因（融合基因两端设计有酶切位点）， 融合基因链接T载体，融合基因信息见表1 :
[0076] 表1HBC-L2融合蛋白基因信息
[0077]
【主权项】
1. 一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：把HPV抗原基因组装到HBc 的基因上，将整合之后的基因通过外源表达获得融合蛋白，融合蛋白自动组装形成类病毒 颗粒VLP，且所述VLP表面展示HPV抗原，得到HBc-HPV VLP。
2. 根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述HPV 抗原基因为HPV晚期转录区编码主要衣壳蛋白L1或HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
3. 根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述HPV 抗原基因为HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
4. 根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述VLP 表面展示的HPV抗原是L1或L2的一个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽，或L1或L2的多 个抗原肽的偶联。
5. 根据权利要求4所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述VLP 表面展示的HPV抗原是L2的两个抗原肽的偶联，所述两个抗原肽的序列为ASATQLYKTCKQA GTCPPDIIPKVEGKTIADQILQ 和 GTGGRTGYIPLGTRPPT。
6. 根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述HPV 抗原肽完全暴露在HBc形成的类病毒颗粒的表面，且展示在HBc VLP表面的抗原肽为多个 拷贝。
7. 根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：在HBc基 因上插入更多的外源基因，且不影响HBc类病毒颗粒的形成。
8. 权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得的可以表达人乳头瘤病 毒抗原肽的类病毒颗粒，其特征在于：为HBc-L2融合蛋白，具有序列表中〈400>8所示的序 列。
9. 根据权利要求8所述的可以展示人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒，其特征在于： 所述HBC-L2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达后可自组装VLP。
10. 权利要求8所述的类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，把HPV抗原基因组装到HBc的基因上，将整合之后的基因通过外源表达系统表达融合蛋白，融合蛋白将自动组装形成类病毒颗粒VLP,且所述VLP表面展示多于一个拷贝的HPV抗原，得到HBc-HPV VLP，该方法有效地增强抗原表位肽的免疫原性，极大的提高了抗原类病毒颗粒的回收率；通过该方法可以获得如序列表<400>8所示序列的类病毒颗粒，该类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面具有应用价值。
【IPC分类】C12N7-04, C12N15-70, A61K39-12, A61P31-20
【公开号】CN104531741
【申请号】CN201410419379
【发明人】邵忠琦, 李军强, 蒋蓉, 杨鸣鸣, 朱涛, 毛慧华, 宇学峰
【申请人】天津康希诺生物技术有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年8月22日