一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条的制作方法
【专利摘要】一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个含有胶体金标记探针的金标垫、一个纤维素膜、一个吸水垫组成，纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC?No.9240的小鼠杂交瘤细胞产生，胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC?No.9239的小鼠杂交瘤细胞产生，质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。本发明敏感性及特异性高，总的敏感性可达83%，特异性为95%。
【专利说明】一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种免疫层析试条，具体来说是一种基于检 测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条。
【背景技术】
[0002] 内脏利什曼病或称黑热病，是由杜氏利什曼原虫种团（Leishmania donovanicomplex)或婴儿利什曼原虫（L. infantum)/恰氏利什曼原虫（L. chagasi)的原虫 寄生于人体的淋巴一巨噬细胞系统所引起的一种寄生虫病，由媒介白蛉叮咬传播。该病在 世界范围内流行甚广，包括亚、欧、非及中、南美洲的61个国家，每年新发生的病例数约有 50万。在上世纪60年代以前我国也深受其害，病例曾达60万，死亡率极高。准确检测感染 和诊断是监测工作急需和治疗的关键所在，因此，对黑热病诊断技术的研究始终受到重视。
[0003] 以骨髓、脾等穿刺物涂片染色镜检的方法是黑热病最古老的诊断方法，迄今仍是 黑热病诊断的"金标准"。国外报道显示骨髓和淋巴结穿刺物涂片镜检敏感性分别为60%? 75%和30%?50%，国内报道以骨髓、淋巴结、脾穿刺涂片镜检检出率依次为：80?90%、 46?87%、96?98%。由于这种检测方法对操作人员的技术要求非常高，在疾病诊断与流 行病学调查中应用受到限制。
[0004] 免疫学方法在黑热病诊断上的应用越来越受到重视，常用检测方法有间接血凝法 (Indirect haemagglutination assay ;IHA)、酶联免疫吸附法（ELISA)、酶联免疫电转移印 溃法（Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ；EITBA),以及金标免疫点印溃 法（Gold-labelled dot blotting;⑶B;俗称膜法或渗滤法）。但这些方法或费时费力、或 需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的要求较高而不适合现场使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提出一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，所 述的这种诊断黑热病的免疫层析试条要解决现有技术中的诊断黑热病的准确率不高，而且 费时费力的技术问题。
[0006] 本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No. 9239。
[0007] 本发明还提供另外一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No. 9240。
[0008] 本发明还提供了一种可特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆 抗体，由保藏号为CGMCC No. 9240的小鼠杂交瘤细胞产生。
[0009] 本发明还提供了另外一种抗原表位不同的可特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛 体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 9239的小鼠杂交瘤细胞产生。
[0010] 本发明还提供了一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个 样品垫、一个紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与所述金标垫 紧密连接的纤维素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述纤维素膜上远 离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，所述 的检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号 为CGMCC No. 9240的小鼠杂交瘤细胞产生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特异 性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 9239的小 鼠杂交瘤细胞产生，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白 (SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)组成。
[0011] 本发明还提供了另外一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括 一个样品垫、一个紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与所述金 标垫紧密连接的纤维素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述纤维素膜 上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中， 所述的检测线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏 号为CGMCC No. 9239的小鼠杂交瘤细胞产生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特 异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 9240的 小鼠杂交瘤细胞产生所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白 (SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)组成。
[0012] 进一步的，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的羊抗鼠 IgG组成。
[0013] 进一步的，特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体E3C3的 喷涂量为0. 1?8 μ g/cm ;胶体金标记探针的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗 原的单克隆抗体A6A2浓度（以蛋白浓度计）：0. 2?2mg/20mL;羊抗鼠 IgG的喷涂量为 0· 1 ?4 μ g/cm〇
[0014] 具体的，所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜（NC膜）或醋酸 纤维素膜；所述支持胶体金标记探针的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所述样品垫可以是 滤血膜样品垫，所述的滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素的混合 物，适合于全血样品和血清样品；所述样品垫也可以是玻璃纤维或吸水纸样品垫，适合于血 清样品；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。
[0015] 具体的，所述纤维素膜宽度控制在2. 5?3. 0mm ;所述吸水垫可宽度为20?40mm， 所述金标垫的宽度为5?10mm ;所述样品垫宽度为20?40mm。
[0016] 进一步的，所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选 择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板（PVC)等。
[0017] 进一步的，可将所述带有背板的免疫层析试条切成3?5mm宽装入一个盒体中，该 盒体对应于滤血膜样品垫的部位设有加样孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗， 检测样品时将全血或血清加入加样孔中。
[0018] 利什曼原虫在黑热病患者体内以无鞭毛体的形式存在，检测病人血样中是否含有 利什曼原虫无鞭毛体循环抗原，可以作为病人感染利什曼原虫的指标。
[0019] 本发明将特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体E3C3固定 在纤维膜上形成检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的杜氏利什曼原虫循环抗 原，在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。
[0020] 本发明采用特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体A6A2作 为检测探针，该胶体金标记探针附着于金标垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可与 受试者血样中的杜氏利什曼原虫循环抗原，结合，从而当受试者血样中存在杜氏利什曼原 虫循环抗原时在检测线位置形成色带。
[0021] 本发明将与胶体金标记探针特异性结合的抗体固定在纤维素膜上作为质控线。胶 体金标记探针是特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆小鼠抗体，相应 的，质控线采用羊抗小鼠 IgG的抗抗体。无论待检样品中是否含有杜氏利什曼原虫循环抗 原，本发明的诊断黑热病中质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常 和免疫层析试条是否变质的标准。
[0022] 与胶体金标记探针特异性结合的质控线不限于使用羊抗鼠 IgG，也可采用金黄色 葡萄球菌A蛋白（SPA)，链球菌G蛋白（SPG)，或者采用其他动物如兔抗鼠 IgG抗体的单抗 或多抗，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。
[0023] 本发明的诊断黑热病的免疫层析试条适用于从亲内脏什曼原虫感染者或黑热病 患者（患畜）体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的诊断黑热病的免 疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫；如果仅仅检测血清样品，本发明的诊断黑热病 的免疫层析的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫，也可采用滤血膜 样品垫。
[0024] 本发明中的细胞株E3C3,属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2014 年5月28号，保藏号为CGMCC No :9240。
[0025] 本发明中的细胞株A6A2，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2014 年5月28号，保藏号为CGMCC No :9239。
[0026] 本发明的免疫层析试条具有以下优点：（1)敏感性及特异性高：实验室考核结果 显示，本发明的免疫层析试条总的敏感性可达83%，特异性为95% ; (2)检测方法简单、快 速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪器和 人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经5分 钟左右的层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为黑热病人的治疗争取了时间，很适合 现场和基层使用；（3)本发明的免疫层析试条可以同时应用与人、畜和野生动物感染的现 场检测，有助于寻找确定传染源，在疾病预防控制工作中有重要意义；(4)制备方法简单， 成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在诊断黑热病及其相关疾病的诊断和治疗中发 挥重要作用，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1、诊断黑热病的免疫层析试条的正面结构示意图。
[0028] 图2、诊断黑热病的免疫层析试条的纵截面结构示意图。
[0029] 其中：1为样品垫；2为金标垫；3为纤维素膜；4为吸水垫；5为检测线；6为质控 线；7为背板。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的制备
[0031] 杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原按如下方法制备：取本实验室保种的杜氏利什 曼原虫801 (MH0M/CN//801/XJ)在NNN培养基中22°C培养的前鞭毛体接种于199培养基 (PH7. 2-7. 4)中于22°C扩大培养。前鞭毛体达到一定密度后，离心收集，转入199培养基 (PH5. 4)中37°C进行无鞭毛体的转化。将转化的无鞭毛体40C下3000g离心15分钟收集无 鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗3次后，按前鞭毛体的压积量加4倍体积的PBS，在液氮 和37°C水浴中，反复冻融5次，然后在冰浴中超声粉碎3次，18000g，4°C离心20min，上清即 为可溶性抗原。用按上述方法制备的抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾细胞与SP2/0瘤 细胞融合，获得的能高效分泌特异抗体的杂交瘤细胞经3次克隆后注射小鼠生产腹水。本 发明在采用杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞S/P20 细胞按常规方法制备杂交瘤时，筛选到两株分泌特异性抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗 原单克隆抗体细胞株：
[0032] (1)E3C3(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No. 9240,保藏日期为2014年5月28日），该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴 定为IgGl型，可以与杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原特异性结合。
[0033] (2)A6A2(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No. 9239,保藏日期为2014年5月28日），该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴 定为IgGl型，可以与杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原特异性结合。
[0034] 实施例2抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原单克隆抗体的制备
[0035] 免疫：每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100 μ g上述纯化的杜氏利什曼原虫无鞭毛 体可溶性抗原+福氏完全佐剂的混悬液，以后每隔1月注射100 μ g纯化的杜氏利什曼原虫 无鞭毛体可溶性抗原+福氏不完全佐剂的混悬液1次，共2次，并于杀鼠取脾进行细胞融合 的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。
[0036] 杂交瘤细胞的产生与筛选：SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的 克隆按本领域常规方法进行。以上述纯化的杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原和谷胱甘 肽-S-转移酶（GST)蛋白分别包板对杂交瘤细胞培养上清进行常规ELISA检测抗体分泌以 筛选杂交瘤细胞株，对GST和重组融合蛋白均反应的克隆其分泌的抗体视为针对GST，所以 只选择保留仅对杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原反应的克隆。
[0037] 单克隆抗体（McAb)免疫球蛋白亚类鉴定：经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液与羊 抗鼠 IgG、IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3在1%生理盐水琼脂板上进行免疫双扩散 以鉴定McAb免疫球蛋白亚类。
[0038] 腹水生产与腹水效价决定：每只BALB/c小鼠腹腔注射5 X 106杂交瘤细胞，1周后 随时观察并取腹水。以纯化的重组融合蛋白包被酶标板，腹水进行倍比稀释，第1稀释度为 1 : 1000,用常规ELISA法确定腹水效价。
[0039] 免疫印迹实验：取培养杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体和10份四川发热病人红细 胞经处理后进行SDS-PAGE电泳，而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后硝酸纤维素膜用 含5%脱脂奶粉的？85溶液室温封闭111，用？85含0.5%1'1^ 〇1^-100(?85-1')洗涤3次，按 1 : 20000稀释度加入单克隆抗体，4°C过夜，用PBS-T洗涤3次，加入用PBS稀释（1 : 5000) 的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体室温摇2h，同法洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用二氨 基联苯胺（DAB)底物系统（DAB5〇mg，PBS100ml，3〇%H20 210 yL)显色。
[0040] 制备得到特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原的单克隆抗体：
[0041] A6A2属于IgGl亚类，与重组抗原反应效价1:51200,用于标记；
[0042] E3C3属于IgGl亚类，与重组抗原反应效价1:51200,用于包被；
[0043] 抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体可溶性抗原克隆抗体的纯化：将含抗杜氏利什曼原虫 无鞭毛体可溶性抗原单克隆抗体的小鼠腹水，先使用正辛酸一硫酸铵沉淀法抽提，然后再 用G蛋白层析柱（美国GE公司产品）按产品说明书纯化单克隆抗体。
[0044] 实施例3诊断黑热病的免疫层析试条的制备
[0045] 1.抗杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体由实施例2制备所得。
[0046] 2.羊抗小鼠 IgG由购买获得。
[0047] 3.制备免疫胶体金探针及金标垫
[0048] 用下述方法制备杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体胶体金探针及金标 垫：
[0049] 1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuC14(沪试牌购于上 海国药集团化学试剂有限公司）配制成〇. 01 %水溶液，取l〇〇mL加热至沸腾，搅动下准确加 入1. 6mL的1 %的柠檬酸三钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。
[0050] 2)确定胶体金偶联探针饱和浓度
[0051] 用0. 2M K2C03调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至8. 0,准备5支洁净试管， 分别加入lmL胶体金溶液。将步骤1)制备的杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体稀 释为lmg/mL，分别向4支试管中加入20 μ L、25 μ L、30 μ L、35 μ L，另一支为空白对照，混匀 后于室温下放置5分钟，加入10% NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶 体金溶液颜色不变时所含最少量即为稳定lmL胶体金溶液所需蛋白的最适浓度，以此为基 础增加20%蛋白量即为胶体金探针饱和溶液。结果：维持胶体金溶液颜色不变的蛋白量为 25 μ L，即探针浓度为20 μ g/mL。
[0052] 3)杜氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫的 制备
[0053] 取50mL胶体金溶液，用0· 2M K2C03调节pH值为8. 0,按20μ g/mL加入已纯化的杜 氏利什曼原虫可溶性抗原的单克隆抗体A6A2,得到免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌15min， 再加入终浓度为1% BSA，搅拌15min，10000g离心30min，弃上清，用10mM HEPES缓冲液洗 涤沉淀，并将其保存于10mL含15%蔗糖的10mM HEPES缓冲液中，得到杜氏利什曼原虫可溶 性抗原的单克隆抗体标记的胶体金探针溶液。取5mL胶体金探针溶液均匀加在玻璃纤维膜 上，相对湿度40%下干燥1小时，得到金标垫。
[0054] 4、诊断黑热病的免疫层析试条的制备
[0055] 该试条的制备方法包括以下步骤：
[0056] 1)NC膜的包被
[0057] 检测线包被：用0. 01M pH7. 4 PBS稀释实施例2制备的杜氏利什曼原虫可溶性抗 原单克隆抗体E3C3至终浓度为2mg/mL，用于包被检测线；
[0058] 质控线的包被：用0· 01M pH7. 4 PBS稀释羊抗小鼠 IgG至终浓度为0· 5 mg/mL，用 于包被质控线；
[0059] BI0D0T公司XZ1000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜（购自 MILLIP0RE公司）上，喷涂量为10 μ L/cm，形成一条检测线和一条质控线，37°C下干燥1小 时。
[0060] 2)诊断黑热病的免疫层析试条的制备
[0061] 用一块单面涂了不干胶的PVC背板，中间粘贴上处理好的NC膜；NC膜靠近质控线 的一端紧密粘贴吸水垫（购于杰一生物公司）；NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴金标垫； 金标垫另一端紧密粘贴滤血膜样品垫（购自杰一生物公司）。得到诊断黑热病试条母板，切 割成4mm宽，加干燥剂后密封保存。
[0062] 5、诊断黑热病的免疫层析试剂盒的制备
[0063] 为了方便使用，将步骤4制备的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条装入检测 盒体中，加干燥剂后密封保存。该检测盒对应于样品垫的部位设有加样孔，对应于检测线和 质控线的部位设有观测窗。
[0064] 实施例5诊断黑热病的免疫层析试条的实验室考核
[0065] 1、检测方法
[0066] 于实施例3制备的免疫层析试条的滤血膜样品垫加入待测血清，1分钟后加入样 本稀释液（PBS) 1滴（约50 μ L)，5分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果判定：如 果检测线5和质控线6均出现红色条带，即判为黑热病；如果仅有质控线6出现红色条带， 即判为阴性；如果质控线不显色，即表明试条失效。
[0067] 1)实验结果
[0068] 用本发明实施例3制备的诊断黑热病的免疫层析的免疫层析试条进行实验室考 核结果如表2所示。由表2可以看出本发明的免疫层析试纸的敏感性可达82. 9%，特异性 可达95. 3%。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于黑热病的快速检测。
[0069] 表2本发明诊断黑热病的实验室考核结果
[0070]
【权利要求】
1. 一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No. 9239。
2. -种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No. 9240。
3. -种可特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为 CGMCC No. 9240的小鼠杂交瘤细胞产生。
4. 一种抗原表位不同的可特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗 体，由保藏号为CGMCC No. 9239的小鼠杂交瘤细胞产生。
5. -种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个紧密 连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与所述金标垫紧密连接的纤维 素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述纤维素膜上远离金标垫的一端 设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其特征在于：所述的检测 线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC No. 9240的小鼠杂交瘤细胞产生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜 氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 9239的小鼠杂交瘤 细胞产生，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白（SPG)或金 黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)组成。
6. 如权利要求5所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特征 在于：所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的羊抗鼠 IgG组成。
7. 如权利要求5所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特征 在于：特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体的喷涂量为〇. 1?8Pg/ cm;胶体金标记探针的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体的浓度 为0· 2?2mg/20mL ;羊抗鼠 IgG的喷涂量为0· 1?4Pg/cm。
8. 如权利要求5所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特征 在于：所述免疫层析试条背面设置一个起支撑作用的背板。
9. 如权利要求5所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特征 在于：将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中，该盒体对应于样品垫的部位设有 加样孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
10. -种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个紧 密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与所述金标垫紧密连接的纤维 素膜、一个紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述纤维素膜上远离金标垫的一端 设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其特征在于：所述的检测 线由特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体组成，由保藏号为CGMCC No. 9239的小鼠杂交瘤细胞产生，所述的胶体金标记探针为抗原表位不同的特异性结合杜 氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 9240的小鼠杂交瘤 细胞产生，所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白（SPG)或金 黄色葡萄球菌A蛋白（SPA)组成。
11. 如权利要求10所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特 征在于：所述的质控线由特异性结合胶体金标记探针的羊抗鼠 IgG组成。
12. 如权利要求10所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其 特征在于：特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体的喷涂量为0. 1? 8Pg/cm;胶体金标记探针的特异性结合杜氏利什曼原虫无鞭毛体虫体抗原的单克隆抗体 A6A2的浓度为0· 2?2mg/20mL ;羊抗鼠 IgG的喷涂量为0· 1?4Pg/cm。
13. 如权利要求10所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特 征在于：所述免疫层析试条背面设置一个起支撑作用的背板。
14. 如权利要求13所述的一种基于检测循环抗原的诊断黑热病的免疫层析试条，其特 征在于：将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中，该盒体对应于样品垫的部位设 有加样孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
【文档编号】G01N33/577GK104142400SQ201410355940
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】汪俊云, 杨玥涛, 石锋, 高春花, 杨益, 周晓农 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所