专利名称：检测抗睾丸抗原自身抗体的免疫测试的制作方法
检测抗睾丸抗原自身抗体的免疫测试本发明涉及用于检测抗睾丸抗原的自身抗体的免疫测试，所述睾丸抗原被看作在与雄性哺乳动物中由于免疫造成的和感染相关的不育方面上是高度相关的。该测试被用于对与偏高水平的抗睾丸抗原自身抗体相关联的疾病的诊断和治疗控制，相关疾病诸如与炎症相关的雄性生育机能紊乱例如精子活力不足，而还可以是睾丸及相关的雄性性器官的征候性炎症。
背景技术：
在德国，近似七分之一的夫妇受非意愿的不育困扰，这里面的原因男女几乎各占一半。在男性这一方面，生育受限的最为重要的数个原因中，除特发性不育症(近似30%) 之外，还有泌尿生殖感染或者其它的免疫方面的因素(共近似12% -15% )0雄性生殖道的系统性急性或者慢性炎症性疾病及局部感染和炎症作为雄性生育机能紊乱的单独病因或者相关联的病因始终发挥重要作用。睾丸的慢性炎症性变化(睾丸的炎症或睾丸炎)可能会导致精子生长停滞并导致精子数量和质量上的重大变化。在美国，附睾的炎症(附睾炎)的估计年发病率为例如600000例，并且通常以组合为附睾-睾丸炎的方式发病。生育机能紊乱在临床上另外与精子不移动和/或精子胶结自身抗体关联。对于免疫引起的雄性不育及其后果的相关性的评估特别地受到期望大量无症状进展的病例的事实阻碍。对于输精管感染的诊断是不令人满意的，该诊断基于病原体检测，即检测精液中白血球和/或炎症介导素含量增大及附腺的分泌活动降低。通过睾丸活检通常仅能够确定地诊断出睾丸的无症状炎症性损伤，由此通常仍不被认为是生育机能紊乱的病因或者起作用因素。因此能够想象到，炎症也是大量特发性不育症患者群中的一部分患者的病因，并且炎症性病因比先前假设的病因具有更高的相关性。因此，需要一种适用于在体液或生物试样中使用的测试，来鉴定炎症性雄性生育机能紊乱，如举例而言的精子不活动及睾丸和相关联的雄性性器官的征候性炎症，以便减小对睾丸活检的需求。粒细胞弹性蛋白酶和IL-6可惜均是非特异性的，因而不适于用作标志物(marker)。迄今为止，还没有适当的标志物，其适于炎症性雄性生育机能紊乱的特异性检测并由此能够在化验分析中使用。发明目的本发明的目的在于提供一种适用于炎症性雄性生育机能紊乱的特异性检测的标志物，和提供一种用于生物试样中的该标志物的检测的易于操作且非侵袭性的方法。目的另外还在于提供一种执行该方法用的测试套件。技术方案根据权利要求，该目的根据本发明通过用于对生物试样中的炎症性雄性生育机能紊乱具有特异性的抗睾丸抗原自身抗体的检测和特异性测定的免疫测试而得以解决。在自身测试中，令人惊讶的是，在生物试样中抗睾丸抗原的特异性自身抗体经鉴定为对男性免疫引起的不育的形成高度相关。这些结果显示，如举例而言具有各种形式的睾丸炎症的患者血清的生物试样通常显示出高滴度的ER-60自身抗体和运铁蛋白抗体滴度并且由此能够与不具有炎症性睾丸缺陷(例如，塞托利细胞仅存综合征、精子生长停滞、少精子症、弱精子症和畸形精子症 (oligoasthenoteratozoospermia))的健康人群或者男性区分开。为此，睾丸正常患者的睾丸浸膏剂通过技术人员已知的2D-SDS-PAGE技术分离， 并且被传送到如《Journal of Pathology))(2005 ；207,127-138)中所公开的硝酸纤维素膜。 用女性的对照血清、健康受试者的对照血清或者用被诊断患有各种形式的病灶或者非经常地患有完全发展的睾丸炎症的经过男科检查后的患者的血清试样来培养渗透膜。用质量光谱法(MALDI-MQ研究自体反应斑，并且鉴定在炎症性不育症男性的血清中经常受抗体抑制的蛋白质。
阳性血清/血清总量 (%反应性)鉴定的蛋白质12/13 (92%)二疏化异构酶ER-60 (类似物Erp60, ERp57)8/13 (61%)运铁蛋白(铁转运蛋白)对照血清对于鉴定的蛋白质不起作用。令人惊讶地，92%的蛋白质二硫化异构酶ER-60(类似物ERp57、p58，产品名 PDIA3_HUMAN)和61%的运铁蛋白(铁转运蛋白)分别地对于患有不同形式的睾丸炎症的患者的血清均表现出强烈的特异性自身反应性。为此，蛋白质二硫化异构酶ER-60(类似物ERp57、p58，产品名PDIA3_HUMAN)和运铁蛋白(铁转运蛋白)被鉴定为雄性哺乳动物的睾丸炎症的特异性标志物。利用这些标志物蛋白质的核酸序列和/或氨基酸序列，提供对于生物试样的免疫检测，该免疫检测允许对抗睾丸抗原自身抗体的特异性检测，特别地允许对与炎症性雄性生育机能紊乱相关联的ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体的特异性检测。用于检测和特异性测定生物试样中的与炎症性雄性生育机能紊乱相关联的抗睾丸抗原自身抗体的免疫测试包括，使抗睾丸抗原自身抗体特别地是ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体与特异性睾丸抗原特别地ER-60或运铁蛋白相结合。根据本发明的测试被用于诊断和治疗性控制雄性哺乳动物的精子不活动，及睾丸及相关性器官的征候性发展炎症。为此，确定雄性哺乳动物的生物试样中的抗睾丸抗原自身抗体特别地是ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体的量，其中所述抗体在患有各种形式的睾丸炎症的患者中频繁出现。然后，将测定的抗睾丸抗原自身抗体的含量与参考值比较。在本发明的优选实施方式中，根据本发明的测试包括测定生物试样特别地是血清中的ER-60自身抗体的含量。为此，以重组体的形式提供睾丸抗原特别地是蛋白质ER-60 作为标志物。这基于ER-60的核酸序列使用通常已知的分子生物法例如通过E. coli中的表达式和根据现有技术的状态例如使用HPLC提纯法来完成，所述核酸序列通过重组体手段在kq ID No. 1中指出。根据本发明，除如kq ID No. 1中公开的蛋白质二硫化异构酶ER_60(类似物 ERp57、p58，产品名PDIA3_HUMAN)的核酸序列之外，还包括通过添加、删除和/或替换形成的核酸序列的微小变化所产生的蛋白质，但条件是转换后的蛋白质的功能基本上不受 ER-60自身抗体的结合的影响。根据本发明，除了所公开的蛋白质二硫化异构酶ER-60的核酸序列之外，还包括同义蛋白质和同源蛋白质，比如ERp57、p58，产品名PDIA3_HUMAN。生物试样是任何的从哺乳动物特别地是从人类获取的包含自身抗体的生物材料， 例如体液比如全血、血清或血浆、精浆、脑脊髓液、腹膜液、唾液、泪液或尿、其它的活检材料或组织。通过特异性地结合到各个睾丸抗原特别地分别是ER-60蛋白质和运铁蛋白并且随后使用适当的检测方法进行检测，而标识出生物试样中存在的抗睾丸抗原的自身抗体特别地是ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体。根据本发明的优选实施方式，通过免疫学方法测定抗睾丸抗原自身抗体特别地是 ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体。特别地在免疫细胞化学方法中，证明通过放射性免疫测定(RIA)进行的测定或者使用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行的测定是特别适合的。替代地，该测试被布置在具有最小的体积要求(smallest volume requirement)的测试载体上，例如被布置在测试带上。免疫测试的进行包括使抗睾丸抗原自身抗体的含量待被测定的雄性哺乳动物的血样或者其它生物标本与吸附的睾丸抗原接触；至少一个清洗步骤，以除去非吸附的成分； 和使用IgG抗体制剂检测与吸附的抗原结合的自身抗体，所述IgG抗体对于待研究雄性哺乳动物具有物种特异性并且能够以物种特异性的方式与自身抗体结合，例如在患者为人类的情况中，抗人类的IgG抗体制剂被标识出以使这些抗体能够用生物素-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶型或者碱性磷酸酶型的级联反应被检测出。在优选实施方式中，通过如下方式进行该测试使待结合的标志物蛋白质特别地是睾丸抗原例如蛋白质ER-60或者运铁蛋白固定在表面上，所述表面例如是微孔板、聚氧乙烯板或者适当的组织板或者测试带，及使非特异性结合部位饱和。待研究的生物试样随后被添加，优选地以液态形式被添加，由此其中包含的自身抗体与睾丸抗原结合，例如 ER-60自身抗体结合到固定的ER-60蛋白质和运铁蛋白自身抗体结合到固定的运铁蛋白。 如果蛋白质ER-60或者运铁蛋白被固定在表面上，则该测试可选地另外检测ER-60自身抗体和运铁蛋白自身抗体。在至少一个清洗步骤之后，第二抗体被添加、与抗睾丸抗原自身抗体结合并且与酶例如碱性磷酸酶或者过氧化物酶联接。在至少一个另外的清洗步骤之后， 与第二抗体联接的酶的无色或者非荧光基片最后被添加到试样。该酶将所述基片转化成为彩色的或者荧光产物，能够利用适当的检测器例如光度计测定该产物的浓度。利用此免疫学上的ELISA含量测定，即便少量的抗睾丸抗原自身抗体特别地是 ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体也能够快速可靠地检测出。该测试的另一个优点在于，它能够通过常用的ELISA装置和商业上可得的具有96、256或甚至IOM个孔的微量滴定板进行，由此允许同时进行大量的分析。在RIA含量测定中，原理上采用如ELISA含量测定中说明的相同的步骤，不同之处在于使用被放射性标记的第二抗体来替代与适当的酶结合的第二抗体。在本示例中，利用闪烁计数器进行定量检测。除上述方法之外，通过结合到标志物蛋白质，即分别地使ER-60自身抗体结合到固定的蛋白质ER-60和使运铁蛋白自身抗体结合到固定的运铁蛋白进行的抗睾丸抗原自身抗体的测定，也能够利用本领域技术人员已知的其它免疫学方法来定性和定量评估，在这些方法中，这里仅提到了蛋白质印迹法和斑点印迹法。可选地，睾丸抗原特别地是ER-60和/或运铁蛋白被施加到具有最小可能的体积要求的测试载体例如被施加到具有在适当的运载物质上的若干个吸附基质的测试带，然后与可能为液态形式的生物试样接触，从而试样中包含的抗睾丸抗原自身抗体能够结合并且随后通过适当的检测系统例如通过形成可视线条而被检测出。对于抗睾丸抗原自身抗体特别地对于ER-60自身抗体结合到固定的ER-60或者运铁蛋白自身抗体结合到固定的运铁蛋白的定性或定量检测优选地在体液如来自个体的血清或者血浆中进行，由此作为结合的手段，例如在450和570nm波长时测定荧光光密度 (OD)。根据450nm波长和570nm波长时的光密度的差确定吸收值。该值与参考值比较。参考值例如根据从健康雄性哺乳动物和/或诊断有睾丸炎症的雄性哺乳动物的生物试样测量的数据计算出。可选地，使用具有限定浓度的睾丸抗原试样，特别地具有限定浓度的ER-60或者运铁蛋白，并且所述参考值例如从参考曲线或者参考表格计算出或者采用用作基准的比较值的形式。参考值优选地与试样分析并行地测定。参考值和试样的双重测定可选地也是可能的。参考值例如使用来自健康供体的生物试样的测量数据计算出，由此在本情况中参考值优选地低于0. 35的OD值。该参考值例如用被诊断患有精子不活动或者征候性发展的睾丸炎症的供体的生物试样的测量数据计算出，由此在本情况中参考值大于0. 35的OD值，优选地大于0. 4的OD值。如果生物试样中的抗睾丸抗原自身抗体的含量，特别地是ER-60自身抗体和运铁蛋白自身抗体的含量大于0. 35的OD值，优选地大于0. 4的OD值，则这标识存在炎症性生育机能紊乱。该免疫测试允许改进的非侵袭性诊断，特别地在具有精子不活动或者征候性炎症性生育机能紊乱患者的生物试样的情况中，并且避免了进行睾丸活检。特别地，利用根据本发明的免疫测试检测ER-60自身抗体和运铁蛋白自身抗体。 这允许将睾丸炎症和炎症性精子发生缺陷(塞托利细胞仅存综合征)的诊断结果区分开。 新的系统分析还考虑到了无联系的变化，比如弥散性的和低密度的淋巴细胞。根据本发明的免疫测试另外用于评估炎症性生育机能紊乱的治疗成功率。由于根据本发明的免疫测试能够容易地被标准化，其可以用于人体医学特别地用在体外受精监测或者用在受精诊断和专家意见中，并且另外还可用于现代的牲畜繁殖。根据本发明，生物试样从雄性哺乳动物中获取，特别优选地从人体中获取。根据本发明的免疫测试能够容易地以易用的“套件”的形式提供，所述套件包括吸附到载体表面的ER-60抗原和/或运铁蛋白抗原、对于待研究雄性哺乳动物具有物种特异性并且能够以物种特异性的方式结合到自身抗体的IgG抗体制剂，例如在人类的情况下，抗人类IgG抗体制剂被标识使得这些能够通过生物素-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶型或者碱性磷酸酶型的级联反应被检测到。可选地，该套件包括载体和另外的缓冲器和试剂，例如检测反应所需要的试剂，如与产生显色反应的标志物联接的抗生蛋白链菌素。可选地，该套件另外包括校准套件所用的ER-60抗体或者运铁蛋白抗体的标准试样，由此ER-60自身抗体的标准试样被用于检测ER-60自身抗体，而运铁蛋白自身抗体的标准试样被用于检测运铁蛋白自身抗体。
具体实施例1.准备 ER-60优选地，在大肠埃希氏菌(E.coli)中表述为重组蛋白质二硫化物异构酶 ER-60(类似物ERp57、p58，产品名PDIA3_HUMAN)。这样例如用包含人类ER-60的NDA 序列的表达克隆来完成，例如在toade等人在1997年的J. Biochem. 122第834至842页中描述的Pet-Her-60表达克隆。该蛋白质例如根据toade等人在J Biochem. 267 (21) 15152-15159提出的规约例如在大肠埃希氏菌BL21 (DE3)中表述，并且例如用HPLC提纯。为此，表达质粒pET_hER60被转换成为大肠埃希氏菌BL21(DE3)并且在适当的条件下被培养，例如在400ml的氨苄西林介质(500yg/ml)中培养，所述介质例如是30°C 下的LB-medium(l%胰胨、0. 5%酵母浸出物，NaCl ;pH 7.0)。蛋白质表达在适当的 OD600nm值例如在OD6tltlnm值=0. 5的情况下被诱导出，例如利用30°C的0. 5mM异丙基-1-硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)进行近似2小时。细菌培养物随后被采集并且团粒被再悬浮在适当的缓冲液中并被析出，例如再悬浮在IOml的缓冲液中比如20mM的HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA (pH 8.0)、ImM PMSF 并进行超声处理。细胞裂解液在4°C下以5000Xg的离心力被离心处理近似30分钟，并且在4°C下利用60%和70%的饱和硫酸铵析出上清液30分钟，随后以5000Xg的离心力进行30分钟离心处理。蛋白质团粒被再悬浮在500 μ 1的缓冲液中，例如20mM HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA (pH 8. 0) UmM DTT，并且例如使用 HPLC 中的凝胶过滤(Superdex 200HR)进行提纯。在可选的步骤中，包含Her-60的这些碎片被进一步提纯，例如使用Mono Q柱例如在IOml的缓冲液中提纯，所述缓冲液例如是20mM的HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA(pH 8. 0) UmM DTT。估计例如SDS-PAGE凝胶中的蛋白质纯度。2.免疫测试ELISA板例如MaxiSorp ELISA板(Nunc)被涂覆重组体ER-60，例如在4°C下在pH 9. 5的0. IM的碳酸钠溶液中以2. 5μ g/ml的重组体密度被涂覆一晚上，然后用适当的缓冲液如磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 2+0. 05% Tween-20)冲洗，并且例如利用2%的脱酯奶粉在 PBS中在室温(RT)下被闭塞2. 5小时。在非特异性结合部位的闭塞之后，待测试的对照试样和血清的稀释系列(范围从未稀释至封闭液中1 1000的稀释度)均被施加双重涂镀并且在RT下被培养1小时。在该培养时间之后，孔被至少清洗一次并且随后被在RT下利用第二物种特异性抗体例如是抗人IgG-生物素(在封闭液中1 100000)培养至少一小时。在至少一个清洗步骤之后，试样在RT下在清洗缓冲液中利用抗生蛋白链菌素-山葵过氧化物酶(GE Healthcare)以1 4000稀释度培养20分钟。在至少一个清步骤之后，显色反应例如通过TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺；BD Biosciences)发展20分钟。显色反应例如通过2N H2SO4被停止。确定波长为450nm和570nm时的吸收(0D值)。根据波长为 450nm和570nm时的差得出吸收值。3.数据分析对于免疫学含量测定的评估优选地通过生物试样中的优选地通过血清或者血浆中的ER-60自身抗体的量化来进行。将测量值与参考值比较。参考值例如通过健康供体试样的测量数据而计算出，并且在本情况中优选地低于0. 35的OD值。替代地，参考值能够通过诊断患有睾丸炎症的供体试样的测量数据而计算出，借此所述参考值在本情况中为大于 0.35的OD值，优选地大于0.4。替代地，具有限定的ER-60浓度的试样被使用并且参考值例如通过对比曲线或者对比表格计算出，或者基于对比值而计算出。参考值优选地与试样分析并行地确定。如果试样中的ER-60自身抗体的含量大于0. 35的OD值，优选地大于0. 4，则标识存在雄性哺乳动物的炎症性生育功能紊乱。4.验证为验证根据本发明的免疫测试，进行外延测试系列，由此在对照组中使用无男科性预存情况的人的血清及正常精液进行的ER-60自身抗体的检测被与不同的患者组进行比较。这些患者组由以下内容构成1.生育受限男性的血清。选取标准精子浓度小于10百万/ml，且没有感染或者炎症征候。2.满足如下标准的男性的血清基于精液检查确定有输精管炎症。3.患有睾丸炎症的男性的血清，借助于睾丸活检检测到睾丸炎症。4.利用双氯芬酸治疗诊断患有睾丸炎症和/或输精管炎症的男性的血清，以评估 ER-60自身抗体滴定量是否与治疗成功相关。
权利要求
1.用于抗睾丸抗原自身抗体的检测和特异性测定的免疫测试，所述睾丸抗原与在哺乳动物的生物取样中的雄性哺乳动物的炎症性生育机能紊乱相关联，其特征在于，所述测试包括将这些自身抗体与特定的睾丸抗原结合。
2.根据权利要求1所述的免疫测试，其特征在于，特定地确定ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体作为抗睾丸抗原自身抗体。
3.根据权利要求1所述的免疫测试，其特征在于，特定的睾丸抗原是ER-60和/或运铁蛋白。
4.根据先前权利要求所述的免疫测试，其特征在于，所述对抗睾丸抗原自身抗体的检测通过放射性免疫测定(RIA)或者通过酶联免疫吸附测定(ELISA)以免疫细胞化学的方式进行。
5.根据先前权利要求所述的免疫测试，其特征在于，所述对抗睾丸抗原自身抗体的检测在具有低体积要求的测试带上进行。
6.根据先前权利要求所述的免疫测试，其特征在于，将所确定的抗睾丸抗原自身抗体的含量与参考值比较。
7.根据先前权利要求所述的免疫测试，其特征在于，进行该测试包括使取自雄性哺乳动物的血样或者其它生物标本与吸附的特定睾丸抗原接触，所述血样或者其它生物标本的抗睾丸抗原自身抗体的含量待测定；至少一个清洗步骤，以除去非吸附的成分；和使用IgG抗体制剂检测与所述吸附的抗原结合的抗睾丸抗原自身抗体，所述IgG抗体对于待研究的雄性哺乳动物具有物种特异性且能够以物种特性异的方式与所述抗睾丸抗原自身抗体结合，并且以如下方式被标识它们通过生物素-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶型或者碱性磷酸酶型的级联反应被检测出。
8.根据先前权利要求所述的免疫测试的使用，以测量抗睾丸抗原自身抗体的含量来确定在雄性哺乳动物中因免疫引起的不育和感染引起的不育的存在，所述抗睾丸抗原与生物取样中的雄性哺乳动物的炎症性生育机能紊乱相关联。
9.用以进行先前权利要求中的任一项所述的免疫测试的套件，其特征在于，所述套件包括特定的睾丸抗原，其被吸附到载体；和IgG抗体制剂，其对于待研究的雄性哺乳动物具有物种特异性且能够以物种特异性的方式与抗睾丸抗原自身抗体结合，并且以如下方式被标识它们通过生物素-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶型或者碱性磷酸酶型的级联反应被检测出。
10.根据权利要求9所述的套件，其特征在于，所述特定的睾丸抗原是ER-60和/或运铁蛋白。
全文摘要
本发明揭露一种用于抗睾丸抗原自身抗体的检测和特异性测定的免疫测试，所述睾丸抗原与在雄性哺乳动物的生物采样中的雄性哺乳动物的炎症性生育机能紊乱有关，特别地用于检测睾丸ER-60自身抗体和/或运铁蛋白自身抗体。该免疫测试用以确定雄性哺乳动物特别地人类的免疫引起的不育和感染相关的不育的存在。
文档编号G01N33/68GK102292639SQ200980143142
公开日2011年12月21日 申请日期2009年10月22日 优先权日2008年10月28日
发明者安德里斯·迈因哈特, 莫妮卡·菲拉科 申请人:尤斯图斯-李比希-吉森大学