专利名称：核酸测序的方法和试剂盒的制作方法
核酸测序的方法和试剂盒发明背景发明领域本发明涉及用于测序目标核酸(DNA，RNA, cDNA等)分子的分子生物学方法、仪器和试剂，从而能够进行既高度平行又长的“读出长度”的核苷酸测序。相关技术的描述DNA是由称作核苷酸的单元组成的长聚合物。该DNA聚合物是单一单元的长链， 其一起形成称作核酸的分子。核苷酸可以是四种亚单元(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤 (G)和胸腺嘧啶(T))之一，当在聚合物中时，它们可携带细胞中的遗传信息。DNA包括两个长核苷酸链，其包括四种不同核苷酸碱基(例如AGTCATCGTAGCT...等)，具有通过酯键连接起来的糖和磷酸基的主链，缠绕成双螺旋并通过互补核苷酸之间的氢键进行连接(A与相反链中的T及C与相反链中的G形成氢键)。沿着主链的核苷酸碱基序列可确定个体的遗传特征。分子生物学的中心法则一般描述生物信息的正常流动DNA可复制为DNA，DNA中的遗传信息可“转录”为mRNA，mRNA中的信息可在一个称为翻译的过程中翻译得到蛋白质， 在该过程中使蛋白质亚单元(氨基酸)按照tRNA(每个tRNA携带由其序列决定的特定的氨基酸)结合mRNA的顺序(由该mRNA的序列和因此由该DNA规定)足够接近以键合。发明概述根据本发明的实施方案公开了测序目标多核苷酸的方法。该方法包括在测定区内提供灵敏检测纳米结构，其在测定区内产生与该纳米结构的性质相关的信号，其中该纳米结构偶联到检测该信号的设备；在测定区内使引物与目标多核苷酸的5'末端区杂交， 从而所产生的引物-目标多核苷酸可操作地偶联到(operably coupled)该纳米结构；在如下条件下向测定区内该引物-目标多核苷酸添加一种或多种核苷酸和聚合酶，所述条件是，当至少一种所添加的核苷酸与该引物下游的目标多核苷酸上的碱基互补时，支持新生链的聚合的条件；以及在测定区内检测添加到新生链的至少一种核苷酸所特有的信号的变化。在该方法的优选实施方案中，该纳米结构的性质是电荷。在该方法的某些实施方案中，所添加的核苷酸还包括电荷物质(charge mass)报道结构部分(reporter moiety)和接头，该电荷物质报道结构部分包括高电荷物质结构部分。在一些实施方案中，该电荷物质报道结构部分设定为可除去的。在一些实施方案中，该电荷物质报道结构部分在检测信号后从所添加的核苷酸中除去。在一些其他实施方案中， 该电荷物质报道结构部分设定为不影响新生链通过聚合酶的聚合。在其他实施方案中，该电荷物质报道结构部分设定为从该新生链突出(protrude out)从而达到该灵敏检测纳米结构。在一些实施方案中，该高电荷物质结构部分包括芳香族的和/或脂肪族的骨架， 该骨架包括叔氨基、醇式羟基、酚式羟基、或其任何组合中的一种或多种。该高电荷物质结构部分可包括一种或多种下述基团或其衍生物
权利要求
1.一种测序目标多核苷酸的方法，其包括
2.权利要求1的方法，其中所述性质是电荷。
3.权利要求2的方法，其中所添加的核苷酸还包括电荷物质报道结构部分和接头，该电荷物质报道结构部分包括高电荷物质结构部分。
4.权利要求3的方法，其中所述电荷物质报道结构部分设定为是可除去的。
5.权利要求4的方法，其中所述电荷物质报道结构部分在检测到信号后从所添加的核苷酸中除去。
6.权利要求3的方法，其中所述电荷物质报道结构部分设定为不影响新生链通过聚合酶的聚合。
7.权利要求3的方法，其中所述电荷物质报道结构部分设定为从所述新生链突出从而达到所述灵敏检测纳米结构。
8.权利要求3的方法，其中所述高电荷物质结构部分包括芳香族的和/或脂肪族的骨架，所述骨架包括叔氨基、醇式羟基、酚式羟基、或其任何组合中的一种或多种。
9.权利要求3的方法，其中所述高电荷物质结构部分包括一种或多种下述基团或其衍
10.权利要求3的方法，其中所述接头包括具有下述通式的分子 H2N-L-NH2其中L包括直链或支链，所述直链或支链包括烷基、烷氧基、或其组合。
11.权利要求10的方法，其中L包括直链，所述直链包括烷基、烷氧基、或其组合。
12.权利要求11的方法，其中所述直链中的碳原子数是1至100。
13.权利要求1的方法，其中所添加的核苷酸还在5'磷酸基处包括可断开的帽分子， 从而阻止另一核苷酸的添加，直到所述可断开的帽被除去为止。
14.权利要求3的方法，其中所述接头结合到所添加的核苷酸的5'磷酸基，由此充当帽。
15.权利要求1的方法，其中多于一个核苷酸被添加到测定区，但是其中直至添加到新生链的前一个核苷酸所特有的信号被检测之后，后继的核苷酸才被添加到该新生链。
16.权利要求1的方法，其中所述引物-目标多核苷酸和所述纳米结构之间可操作的偶联包括将所述引物固定到所述灵敏检测纳米结构。
17.权利要求1的方法，其中所述引物-目标多核苷酸和所述纳米结构之间可操作的偶联包括将所述目标多核苷酸固定到所述灵敏检测纳米结构。
18.权利要求1的方法，其中使所述引物与所述目标多核苷酸杂交包括使所述引物与已经连接到所述目标多核苷酸5'末端的寡核苷酸杂交。
19.权利要求1的方法，其中所述灵敏检测纳米结构选自由以下各项组成的组纳米线、纳米管、纳米间隙、纳米珠、纳米孔、场效应晶体管(FET)-型生物传感器、平面场效应晶体管和任何传导纳米结构。
20.权利要求1的方法，其中所述目标多核苷酸和所述引物包括选自由下述各项组成的组的分子DNA、RNA、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁定核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸 (TNA)、合成核苷酸聚合物、及其衍生物。
21.权利要求1的方法，其中所添加的核苷酸包括选自由下述各项组成的组的分子脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核苷酸、吗啉代、锁定核苷酸、乙二醇核苷酸、苏糖核苷酸、合成核苷酸、及其衍生物。
22.权利要求1的方法，其中所述检测所述信号的设备选自由下述各项组成的组压电检测、电化学检测、电磁检测、光检测、机械检测、声波检测和重量分析检测。
23.测序目标多核苷酸的装置，其包括微流体盒，所述微流体盒包括样品接收元件，其用于将包含所述目标多核苷酸的生物样品引入到所述盒中；溶解室，其用于破坏所述生物样品以释放包含核酸和其它分子的可溶组分；核酸分离室，其用于将所述核酸与所述可溶组分中的其它分子分开；扩增室，其用于扩增所述目标多核苷酸；测定区，其包括一个或多个灵敏检测纳米结构的阵列，所述纳米结构产生与所述纳米结构的性质相关的信号，其中所述测定区设定为允许所述目标多核苷酸可操作地偶联所述纳米结构；和传导元件，其用于将所述信号传导到检测器。
24.权利要求23的装置，其中所述生物样品包括任何体液、细胞及它们的提取物、组织及它们的提取物、和任何其它包含所述目标多核苷酸的生物样品。
25.权利要求23的装置，其中对所述装置进行大小调整并且设定为手持式的。
全文摘要
本公开的多种实施方案一般涉及用于目标核酸(DNA，RNA，cDNA等)分子测序的分子生物学方案、仪器和试剂。
文档编号G01N27/414GK102203288SQ200980142508
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者乔纳森·奥汉隆 申请人:康特姆斯集团有限公司