直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法
【专利说明】直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及核酸扩增的领域，特别是涉及使用聚合酶链反应扩增核酸的用途。为 容易地扩增核酸样品，本发明提供可用于通过冻干或冷冻-干燥核酸扩增试剂扩增核酸的 方法和试剂盒。本发明具有在容易地处理核酸中的应用和在基因分型、诊断和法医方面是 特别有用的。
[0002] 发明背景 聚合酶链反应（PCR)是用于分子生物学供扩增核酸的常见工具。US4683202 (Mullis, Cetus Corporation)描述了用于扩增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列 的方法。
[0003] US5705345 (Lundin等人）描述了核酸制备的方法，其中含有细胞的样品被溶胞 以释放核酸和样品用环糊精处理以中和萃取剂。这种系统的优点是传统的去垢剂去除需要 一个分离步骤；然而加入环糊精以中和去垢剂排除了对分离步骤的需要，因此减少了污染 的危险。
[0004] W0"38962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一种具有结合的溶胞试剂的 固体支持体。溶胞试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选的RNA消化酶。用于PCR扩增的方 法需要纯化核酸用于扩增分析的其它步骤。
[0005] W09102040 (Kosak)描述了在扩增反应混合物中使用环糊精标记的引物用于定性 和定量核酸序列分析的发明。该发明的益处是更高的信号效率和标记颜色的通用性。
[0006] W09532739 (Agrawal)描述了与环糊精非共价复合的寡核苷酸。然而环糊精与寡 核苷酸的结合是用于寡核苷酸的细胞摄取而不用于PCR反应中的核苷酸的扩增。
[0007] W02010066908 (Beckers等人，）描述了环糊精改进PCR的特异性、灵敏度和/或 产率的用途。该方法公开在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行的扩增反应且该扩增 反应在反应混合物上进行。该PCT申请公开了用于在样品中扩增目标核酸的试剂盒，所述 试剂盒在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自PCR试剂列表的成分。该申请还 公开试剂盒可作为包含几种成分的预混合物提供，其也可以脱水的冻干的形式提供。然而， 该申请中没有这样冻干的预混合试剂盒或者甚至此类试剂盒可如何制备的实例。
[0008] 用于DNA扩增的当前方法涉及通常包含几个步骤的DNA纯化程序，其增加污染的 机会。这是一个繁琐的过程，而现有技术的方法在成本、复杂性和特别是用户的时间方面具 有许多明显的缺点。例如，基于柱的核酸纯化是典型的纯化核酸的固相提取方法。这种方 法依赖于通过吸附结合于二氧化硅或其它支持体（取决于缓冲液的PH和盐含量）的核酸。 合适的缓冲液的实例包括Tris-EDTA (TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液（由于反应性胺而用于 DNA微阵列实验）。在这样的离心柱（spin column)上的核酸纯化包括许多复杂和繁琐的 步骤。在离心柱上的核酸纯化通常包括3个耗时和复杂的步骤/阶段： 将含有核酸的样品加入到柱中和由于结合溶液的较低的PH (相对于在柱上的硅烷 醇基）和盐浓度所致核酸结合，所述结合溶液可含有缓冲液、变性剂（如盐酸胍）、Triton X-IOO、异丙醇和pH指不剂； 用5 mM KPO4 pH 8· O或类似的，80% EtOH)洗涤柱；和 用缓冲液或水洗脱柱。
[0009] 备选方法包括在离液剂的存在下核酸的结合，以致DNA结合于二氧化硅或玻璃颗 粒或玻璃珠。这个属性被用于在碱性条件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠纯化核酸。典型的 离液剂包括硫氰酸胍W或盐酸胍纖，最近玻璃珠已被含有玻璃的微柱取代。
[0010] 定量实时逆转录聚合酶链反应的某些缺陷，包括抑制剂的作用，由Bustin & Nolan (J. Biomolecular Techniques, 2004，15，155-166)描述。
[0011] 在法医应用中针对PCR扩增失败的最好防御是将合理的样品处理和加工技术与 被证明有效纯化DNA的提取系统结合。
[0012] 典型地，PCR试剂贮存在必须维持在低于室温的温度下的甘油溶液中。冻干法或 冷冻干燥是一种广泛用于制备供核酸分析和其它生物过程的试剂的方法，因为它允许否则 不稳定的生物分子的长期稳定性，并提供一种储存、运输和重构的便利方法。然而在涉及制 备用于PCR分析的冻干或冷冻-干燥的试剂方面存在许多技术挑战。制备干燥生物试剂组 合物的当前技术包括诸如干式混合、喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥和/或低温冷冻的步 骤。所有这些步骤都有限制和缺点，包括一致性和可靠性。
[0013] 在干式混合技术（Muzzio等人2002, /Wofer TechnologyY2A,卜7)的情况下，由 于化学物的不同的密度，往往很难获得均匀的化学物的共混物。此外，当极小量的成分与大 量的其它成分混合时，均匀性是尤其难以获得的。即使获得均匀性，也难以可重复地分散小 量的共混的生物化学物。
[0014] 由于试剂首先溶于溶液中，喷雾-干燥技术（US4712310)提供更均匀的化学物的 共混物。然而，在喷雾-干燥的情况下，分发精确量的共混化学物是困难的。为克服这个缺 点，产生的颗粒通常通过团聚再加工以获得均匀的颗粒大小如片剂。然而，团聚的颗粒通常 比原始喷雾-干燥的颗粒或粉末更不溶。同样，这些程序有时使用可对环境有害的碳氟化 合物低温溶液。
[0015] 流化床技术（Rubina, 1999，TfecAffo/ogT'，23, 104-113)依赖 于将液体试剂共混物喷雾到颗粒上并干燥液体以获得用共混的试剂包被的颗粒。使用该程 序，难以获得均匀大小的颗粒并产生均匀的包衣。
[0016] 用于稳定生物制剂的另一种方法是冷冻-干燥。冷冻-干燥的一个缺点是使用难 以处理的碳氟化合物制冷剂和冷冻-干燥过程可能是不精确的并且还难以调节。确实，试 剂的常规冷冻干燥不能提供对用于分子生物学过程的特别不稳定试剂的完整解决方案。此 外，产品在冷冻干燥过程期间的降解是常见的和冷冻干燥的产品在存储期间并不总是完美 稳定的。过程控制是至关重要的并且可能难以调节（Tang & Pakil, 2004，药物冷冻-干 燥方法的设计：实用建议（Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: Practical Advice) -,Pharmaceutical Research, 21, 191-200) 〇
[0017] 稳定生物制剂的另一种方法是通过空气-干燥生物试剂组合物（Ratti，2001， 高价值食品的热空气和冷冻-干燥：评述（Hot Air and Freeze-Drying of High Value Foods: A Review) : A Review. J. Food Engineering 49, 311-319)。使用空气干燥方法 的一些问题是，干燥的产品并不以可容易分散的形式存在。而且，生物试剂在或高于干燥过 程的温度下必须是稳定的并且精确控制是一个困难的过程。
[0018] 使用冷冻-干燥技术的一个特化方法是形成液滴或球，其与低温液体接触，然后 冷冻干燥。该技术的一个缺点是试剂球是脆弱的且易于崩解。
[0019] 用于稳定生物试剂的载体或填充剂的一个类型是形成玻璃的填充材料 (US5565318)。将生物试剂溶液掺入形成玻璃的填充材料（其为水溶性的或水溶胀性物质） 中。然后将它们干燥以产生一种固定和稳定生物试剂的玻璃状组合物（US5593824)。
[0020] 碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽三糖是一组重要的玻璃形成物质。可使 用其它多羟基化合物如碳水化合物衍生物像山梨醇和化学改性的碳水化合物。另一种重要 类别的玻璃形成物质是合成的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺。
[0021] 玻璃形成物质的其它实例包括糖共聚物如Ficoll? (US3300474)。Ficoll是一种 易溶于水性溶液的中性的、高度支化的、高质量、亲水性多糖。Ficol 1的半径范围为2-7 nm。 其通过多糖与表氯醇的反应来制备。Ficoll具有在5, 000-1，000, 000之间的分子量并包含 通过醚键连接至双官能团的蔗糖残基。这样的基团可以是2、3或更多个碳原子，但通常不 超过10个碳原子的亚烷基。双官能团起着将