一种玉米素核苷含量测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种玉米素核苷含量测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]植物激素(planthormone)是指在植物体特定部位合成的，并从合成部位运往植物体其他部位对植物体整个生命活动起显著调节作用的微量有机物，也被称为植物天然激素或植物内源激素。目前公认的植物内源激素共有五大类，即生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸、乙烯。
[0003]玉米素核苷是最活跃和普遍以天然形式存在的细胞分裂素。细胞分裂素能促进细胞分裂，诱导芽的增殖，抑制根的形成，延缓衰老过程和激活基因的表达和促进一般代谢。对成熟的植物，天然细胞分裂素在最旺盛生长期具有高的激素水平。
[0004]目前市面上已有的检测激素的方法可分为三大类，生物鉴定法，免疫检测技术以及高效液相检测技术。生物鉴定法虽然简单，但对样品的纯度要求较高，需要复杂的样品前处理，同时专一性以及重复性较差。免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长。色谱技术近些年飞速发展，在植物激素的检测中越来越广泛。但是现在市面上基于高效液相色谱的检测技术，对于样品的前处理普遍繁琐，且损失率较高。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种玉米素核苷含量测定试剂盒及其方法，可快速准确的测算出玉米素核苷的含量。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种玉米素核苷含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，液体X I瓶，4°C保存，由甲醇、乙酸和蒸馏水混合而成，置于60mL试剂瓶中； 试剂二，液体X I瓶，4°C保存，由石油醚组成，置于10mL试剂瓶中；
试剂三，液体X I瓶，4°C保存，由甲醇组成，置于50mL试剂瓶中；
试剂四，液体X I瓶，4°C保存，由冰乙酸组成，置于50mL试剂瓶中；
试剂五，玉米素核苷(ZR)标准品Xl支，-20°C保存，由玉米素核苷组成，置于1.5 mL EP管中。
[0007]进一步的，所述试剂一中，甲醇的体积为45mL，乙酸的体积为3mL，蒸馏水的体积为12mL；
进一步的，所述试剂二中，石油醚的温度为30-60°C，体积为10mL;
进一步的，所述试剂三中，甲醇的体积为50mL;
进一步的，所述试剂四中，冰乙酸的体积为50mL;
进一步的，所述试剂五中，玉米素核苷的质量为0.5 mg。
[0008]一种基于高效液相色谱法的玉米素核苷含量测定方法，包括以下步骤:
步骤I仪器和用品的准备；
高效液相色谱仪、低速离心机、氮吹仪、溶剂抽滤装置、有机系针头式过滤器(50个，0.224111)、水系滤膜(0.454111)、有机系滤膜(0.454111)、(:18柱(4.6 X250 mm)、可调式移液器、样品瓶(50个，2mL)、色谱级甲醇(500 mL)和超纯水；
步骤2溶剂的除杂处理；
将500 mL超纯水用0.45μπι的水系滤膜抽滤，将500 mL甲醇用0.45μπι的有机系滤膜抽滤，分别除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；
步骤3流动相的配制；
取200mL除杂后的甲醇和300mL除杂后的超纯水混合，并加入3mL所述试剂四，混匀，配成流动相；
步骤4溶剂的脱泡；
将配好的流动相超声20分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱；
步骤5玉米素核苷的提取；
称取0.1g样本，放入研钵中磨碎，加入ImL预冷的所述试剂一，4°C浸提过夜后，采用离心率8000g离心10分钟，取出上清液;残渣用0.5mL所述试剂一浸提2小时，离心后取出上清液;合并两次上清液，40°C减压蒸发至不含有机相(约剩0.3mL水溶液)，加入0.5mL所述试剂二，萃取脱色3次，弃去上层醚相，下层40°C减压蒸干，加入0.1mL所述试剂三，溶解混匀，采用针头式过滤器过滤后待测；
步骤6标准品的配制；
在所述试剂五中加入ImL甲醇，配成500yg /mL母液，将所述母液用甲醇分别稀释成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL、10yg /mL和5yg /mL的玉米素核苷标准品溶液，分别将五组不同浓度的玉米素核苷标准品溶液采用针头式过滤器过滤后待测；
步骤7玉米素核苷含量测定操作步骤；
1)开启电脑、检测器和栗，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量1yL，流速0.8 mL/min，柱温35°C，保留时间15min，检测波长254nm，设置完毕保存方法组；
2)启动输液栗，使流动相通过色谱柱，待基线稳定后开始加样；
3)分别加入五组不同浓度的玉米素核苷标准品溶液10yL，在15min内可分离玉米素核苷，玉米素核苷的保留时间为6min左右，(柱子不同，保留时间有差异)，计算五组不同浓度的玉米素核苷标准品的峰面积；
4)加入样品10yL，在相应保留时间处检测溶液的峰面积；
步骤8玉米素核苷含量的计算；
以标准品浓度(yg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标计算玉米素核苷标准曲线，将样品峰面积代入标准曲线，计算样品玉米素核苷含量。
[0009]本发明的有益效果是:
1、采用本发明试剂盒进行的玉米素核苷含量方法的样本前处理过程简单易操作，只需石油醚萃取就可上样检测，大大节省了测试时间。
[0010]2、采用本发明试剂盒进行的玉米素核苷含量方法的提取液成分简单，只需甲醇跟水的混合溶液(pH=3)提取，大大降低了测试成本。
[0011]3、采用本发明试剂盒进行的玉米素核苷含量方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，而且每一个样品只需十分钟时间，相比其他方法时间大大缩短。
[0012]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的【具体实施方式】由以下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0013]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0014]—种玉米素核苷含量测定试剂盒，包括以下试剂:
试剂一，液体X I瓶，4°C保存，由45mL甲醇、3mL乙酸和12mL蒸馏水混合而成，置于60mL试剂瓶中；
试剂二，液体X I瓶，4°C保存，由10mL温度在30-60°C的石油醚组成，置于10mL试剂瓶中；
试剂三，液体X I瓶，4°C保存，由50mL甲醇组成，置于50mL试剂瓶中；
试剂四，液体X I瓶，4°C保存，由50mL冰乙酸组成，置于50mL试剂瓶中；
试剂五，玉米素核苷(ZR)标准品X I支，_20°C保存，由0.5 mg玉米素核苷组成，置于1.5mL EP管中。
[0015]玉米素核苷在254nm下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。
[0016]—种基于高效液相色谱法且利用上述试剂盒的玉米素核苷含量测定方法，包括以下步骤:
步骤I仪器和用品的准备；
高效液相色谱仪、低速离心机、氮吹仪、溶剂抽滤装置、有机系针头式过滤器(50个，
0.224111)、