miR-520c核苷酸的用途、药物组合物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及内源性非编码小RNAs的新药用途技术领域，尤其是一种miR-520c核巧 酸的用途、药物组合物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病，发病率有逐年增高且呈年轻化的趋势大量 临床研究显示，肿瘤的转移是造成临床死亡的最主要原因。侵袭转移是癌细胞从原发性部 位转移到远端部位形成肿瘤的过程，它是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是导致肿瘤复发 和影响预后的重要因素，肿瘤发生侵袭和转移是一个多因素调控、多步骤、多阶段、连续复 杂的生物学过程。对肿瘤转移的细胞生物学与分子调控机制不断地深入研究，如何检测癌 细胞的侵袭转移W实现肿瘤的早期检测与评估，已成为抗癌转移研究的重要共识。
[0003] MicroRNA (miRNA)是真核生物中一类长度约为22个核巧酸的参与基因转录后水 平调控的非编码小分子单链RNA，能通过与祀mRNA特异的碱基配对引起祀mRNA的降解或 翻译抑制，从而对基因进行转录后的表达调控。目前普遍认为miRNA参与的基因调控是遗 传程序中最基本的一步，调控细胞分化、生长、调亡、代谢等功能。由于肿瘤本质上是一种多 基因异常疾病，通过激活一种或多种原癌基因的表达及抑癌基因的突变缺失从而使肿瘤细 胞逃避了正常生长调控机制，自主进行增殖和侵袭、出现恶性表型。研究表明多种miRNAs参 与了肿瘤细胞重要的生物程序调控，直接或间接的起着促癌基因或抑癌基因的功能。在肿 瘤的发生与发展中起了至关重要的作用。因此，将miRNA作为肿瘤疾病治疗的祀点，开发相 关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可W同时作用多个祀基因 mRNA水平的表达， 影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在肿瘤不同发展阶段的表达 水平不同，因此，可W通过检查miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
[0004] 目前研究发现许多miRNA通过调控细胞增殖与细胞迁移相关祀蛋白的表达，影响 肿瘤细胞的恶性增殖与转移，运些miRNA有促进增殖的，也有抑制增殖的。寻找在肿瘤中特 异性表达。参与肿瘤细胞迁移的miRNA,阐明其作用机制，对于开发队niRNA为策略的肿瘤疾 病的诊断、治疗具有极其重要的意义的应用前景。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有的不足，本发明提供了一种miR-520c核巧酸的用途、药物组合物和 试剂盒。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种单链非编码miR-520c核巧酸的 用途，miR-520c核巧酸在用于诊断或预后实体瘤药物或试剂盒中的用途，所述miR-520c核 巧酸序列为沈Q ID N0:1 所示的miR-520c-3p的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W 及沈9 10備：2所示11111?-520。-5口的序列：5'-抓(1^64666446〔4抓1]1]抓(：-3'。
[0007] 根据上述方案，进一步包括:所述实体瘤选自鱗状细胞癌，乳头状腺癌，囊腺癌，乳 头状腺癌，恶性多形性腺瘤中的一种或多种。
[000引一种用于诊断或预后实体瘤药物组合物，药物组合物由如下组成:miR-520c，药学 上可接受的载体、病毒或辅料。
[0009] 根据上述方案，进一步包括:所述miR-520c核巧酸序列为SEQ ID N0:1所示的miR- 520。-化的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W及沈Q ID N0:2所示miR-520c-5p的 序列： 5'- CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC-3'； 所述 miR-520c 含量为 0.1-lOg/ml。
[0010] 根据上述方案，进一步包括:所述的载体选自胆固醇、纳米颗粒、腺病毒和脂质体 中的一种或多种;所述病毒选自腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒等中的一种或多 种；所述辅料选自PEG-PLA、PEG-DSPE、PEG-P化、PLGA等中的一种或多种。
[0011] 根据上述方案，进一步包括:所述的药物组合W 口服或注射方式给药。
[0012] 根据上述方案，进一步包括:所述注射方式为静脉注射或肌肉注射。
[001引一种用于诊断或预后实体瘤试剂盒，所述试剂盒中含有miR-520c、生理盐水和缓 冲液： 所述miR-520c核巧酸序列为SEQ ID N0:1所示的miR-520c-3p的序列：5'- AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU-3'；W及SEQ ID N0:2所示miR-520c-5p的序列：5'- CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC-3'； 所述生理盐水为浓度0.9%氯化钢生理盐水； 所述缓冲液为化is-肥1缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD'S缓冲液中的一种或多种的组 厶 1=1 一种上述的药物组合物或上述的试剂盒在制备用于诊断或预后实体瘤中的用途。
[0014] 根据上述方案，进一步包括:所述实体瘤选自鱗状细胞癌，乳头状腺癌，囊腺癌，乳 头状腺癌，恶性多形性腺瘤中的一种或多种。
[0015] 本发明的有益效果是，本发明通过实验发现miR-520c在鱗状细胞癌和乳头状腺癌 中表达显著下调，并与肿瘤患者的分期，转移W及预后相关。通过构建miR-520c过表达和荷 瘤小鼠中过表达miR-520c的表达发现，miR-520c过表达在细胞水平能抑制细胞增殖与迁 移，荷瘤小鼠中过表达miR-520c与对照组相比肿瘤大小与肿瘤重量有了明显的降低，同时 肿瘤相关基因的表达与对照组相比有了明显的降低。
[0016] 具体的，本发明发现miR-520c在肿瘤细胞与正常对照相比有了明显的下降，对肿 瘤细胞增殖、细胞迁移与对照组相比都有了明显的下降。荷瘤小鼠 miR-520c过表达小鼠在 肿瘤体积，肿瘤大小，小鼠体重方面与野生型相比都有了明显的降低。W上实验说明miR- 520c能够抑制肿瘤细胞的增殖与肿瘤的生长转移，运意味了 miR-520c可作为一种早期诊断 和早期预防肿瘤的生物标志。
[0017] W上实验说明miR-520c通过抑制鱗状细胞癌和乳头状腺癌细胞增殖对肿瘤生长 具有保护作用，它对许多肿瘤疾病具有潜在的预防和治疗价值，可称为一种治疗肿瘤的药 物。具体的，可W合成miR-520c的核巧酸并与适当载体如胆固醇，纳米颗粒，腺病毒，脂质体 等连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射的方式，对鱗状细胞癌和乳头状腺癌等肿瘤疾 病进行治疗。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0019] 图1为miR-520c在正常组织与肿瘤组织中的表达比较。
[0020] 图2为miR-520c在不同肿瘤分期中的表达比较。
[0021] 图3为miR-520c在肿瘤患者转移与未转移中的比较。
[0022] 图4为miR-520c在肿瘤患者预后中表达比较。
[0023] 图5为miR-520c过表达在肿瘤细胞增殖中与对照组相比抑制肿瘤细胞增殖。
[0024] 图6为miR-520c过表达在肿瘤细胞迁移中与对照组相比抑制肿瘤细胞迁移。
[00巧]图7为荷瘤小鼠中miR-520c过表达，与对照组在检测肿瘤体积大小中的比较。
[00%]图8为荷瘤小鼠中miR-520c过表达，与对照组在肿瘤重量大小中的比较。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例来进一步描述本发明 除非特别指明，W下实施例中所用的小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。
[002引除非特别指明，W下实施例中所用的实验方法均为本领域中所用的常规方法。
[0029] 除非特别指明，W下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可W从正规渠道 商购获得 实验例1 miR-520c在肿瘤组织W及不同肿瘤分期中的表达情况检测 ①选择2010年10月至2014年6月我院病理资料保存完整的肿瘤患者85例，年龄35-76， 平均50.8岁，所有患者均经病理检查确诊，均无其他重要脏器合并症或肿瘤所有研究对象 均知情同意。收集手术切除的新鲜正常组织，肿瘤组织W及肿瘤患者的病理切片，肿瘤组织 采用TrizoKinvitrogen)，病理切片使用mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion，按照标 准操作步骤)提取RNA，使用RIPA裂解液提取组织中的蛋白。RNA浓度与纯度和蛋白质浓度采 用化och(BioTeck)分光光度计检测。
[0030] ②通过Q-PCR检测miR-520c在肿瘤组织中的表达变化。提取的RNA用Reved AidTM First Strand cDNA Synthesis KiUF'ermen^s)，按照操作说明逆转录为cDNA，采用 ABI- Vii7 Real-time