硫醇基官能化试剂及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200980154905. 1、发明名称为"硫醇基官能化试剂及其用途"的 申请的分案申请，该母案申请是2009年12月21日提交的PCT申请PCT/GB2009/002924进 入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及官能化试剂以及利用它们修饰蛋白质和多肽的方法。本发明还涉及通 过本发明方法制备的官能化多肽的用途。更具体而言，本发明应用与偶联伴侣（coupling partner)共价连接的官能化试剂，所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂 环。典型地，所述偶联伴侣（例如聚（亚烷基二醇）分子或聚糖基团）能够改变多肽的性 质。
【背景技术】
[0003] 现有技术中已知，可使聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)聚合物与治疗性多 肽共价连接，该过程称为聚乙二醇化（PEG化）。通常典型地使用包含官能团（例如羟基、巯 基、胺基或羧酸基团）的衍生物使多肽与PEG分子的反应性衍生物反应来进行PEG化。在 PEG化反应中，PEG分子的反应性官能团与多肽中存在的氨基酸的氨基、羧基或硫醇基基团 或者与多肽的反应性N-末端或C-末端形成稳定的共价键。一般而言，PEG化反应需要使 用反应性交联剂，例如马来酰亚胺。
[0004] 然而，还已知PEG化是相对不受控制的反应，主要是因为使用反应性交联剂，并且 因为PEG分子可以多种不同的方式与多肽中存在的多个官能团反应，从而产生不均一的产 物。这意味着所得PEG化多肽可具有直链或支链结构和/或可具有可变数量的与每个多肽 偶联的PEG分子。该反应还受诸如蛋白质类型和浓度、反应时间、温度和pH值的因素的影 响，所有这些因素均对反应最终产物有影响。
[0005] 一般而言，进行PEG化以影响多肽（尤其是静脉内施用的那些）的药代动力学或 免疫学特性。特别地，可对多肽进行改变以改善其稳定性、生物半衰期、水溶性和免疫学特 性。认为对多肽进行PEG化使其质量增加（例如增加20-50kDa)意味着其更不容易通过肾 脏排泄，因此在体内存在更长时间。此外，认为PEG化多肽被保护而不受内源性酶的降解。 这也有助于延长其体内半衰期。还认为延长体内半衰期和提高多肽药物效力可导致降低患 者需要的多肽的频率或剂量，从而有助于降低针对多肽的免疫反应。PEG化还可有助于提高 疏水性多肽的水溶性。
[0006] 然而，虽然PEG化多肽的特性是所期望的（尤其是对于治疗性多肽而言），但是在 PEG化反应中缺乏控制仍然是一个问题，因为这常常得到一系列具有多种不同特性的产物。 此外，因为多肽是复杂分子，所以难以使用保护基来控制反应的位点和/或程度，例如这在 小分子化学中是可能的。
[0007]多肽糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。从本质上来说， 糖基化是由导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰的酶促过程介导的。在N-连接的 糖基化中，聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮相连，在o-连接的糖基化中，聚糖与丝氨酸和苏 氨酸侧链的羟基氧相连。其它形式的糖基化包括与丝氨酸的羟基氧相连的糖胺聚糖、其中 聚糖与神经酰胺相连的糖脂、不与蛋白质或脂质相连的透明质酸、以及通过聚糖连接使蛋 白质与脂质相连的GPI锚定蛋白。
[0008] 现有技术中存在的普遍问题是糖基化常添加到真核细胞中的多肽上，而很少添加 到在常用治疗性多肽重组表达的原核宿主中表达的多肽上。在原核宿主中产生的多肽缺少 糖基化可导致所述多肽被识别为异物或者意味着它们具有不同于其天然形式的其它特性。 难以通过基因工程在多肽的非天然糖基化位点上进行糖基化以试图将这用于调节多肽特 性也是一个问题。
[0009]WO88/05433公开了用于制备多肽与信号产生或细胞毒性化学实体之缀合物的交 联剂。所述交联剂由一系列含氮芳香杂环化合物组成，特别是2_、3_或4-乙烯基吡啶和乙 烯基嘧啶，所述信号产生或细胞毒性化学实体可通过所述交联剂中存在的活化酯取代基与 所述含氮芳香杂环化合物相连。缀合反应在于使所述试剂的乙烯基与多肽中存在的硫醇基 反应。WO88/05433中公开的化合物均包含吸电子取代基作为所述含氮芳香杂环的官能团。 还应当注意的是，WO88/05433未提供任何表明利用交联剂使信号产生或细胞毒性化学实 体与多肽相连的实施例。
[0010] WO2005/024041描述了用于蛋白质组学方法中的对两个或更多个细胞群中蛋白 质加质量标签的方法。该加标签方法包括使一个群中的半胱氨酸残基与2-乙烯基吡啶反 应，而另一个群中的半胱氨酸残基与CV4烷基取代的2-乙烯基吡啶反应，从而产生具有可 通过质谱区分之质量的加标签蛋白质。
[0011]Banas等人（BiochimicaetBiophysicaActa，957 (2) : 178-84,1988)研究了大 肠杆菌（E.coli)磷酸果糖-1-激酶半胱氨酸残基的反应性，利用乙烯基吡啶、溴代丙酮酸 酯和二硫代硝基苯甲酸来确定多肽中存在的6个半胱氨酸残基的相对反应性。
[0012] Fullmer(AnalyticalBiochemistry，142 (2) :336_9,1984)描述了 改进肤中氨基 酸组成分析的方法，特别是半胱氨酸和色氨酸鉴定的方法。改进之一采用4-乙烯基吡啶来 保护二硫键还原断裂之后肽中存在的一半半胱氨酸残基，因为所产生的半胱氨酸衍生物对 酸水解稳定。
[0013] 现有技术中在改善用偶联伴侣（如PEG分子和聚糖基团）衍生化多肽方面仍然存 在问题。
【发明内容】
[0014] 概括而言，本发明涉及用例如聚（亚烷基二醇）分子和聚糖基团的部分对多肽进 行官能化的化合物及其使用方法。该化学是基于包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的 官能化试剂之上的，所述乙烯基取代基能够与多肽中天然存在的或被引入其中的一个或更 多个硫醇基反应，例如通过使用一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基。一般而言，所述官能 化试剂与聚（亚烷基二醇）分子（例如聚乙二醇（PEG)分子）或聚糖基团共价连接，因此 所述乙烯基与多肽中硫醇基之间的反应使得所述多肽与所述聚（亚烷基二醇）分子和/或 所述聚糖基团共价连接。
[0015] 因此，在一个方面中，本发明提供了这样的方法，其包括使具有至少一个反应性硫 醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代 基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚（亚烷基二醇）分子和/ 或聚糖基团共价连接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从 而使所述聚（亚烷基二醇）分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
[0016]在另一个方面中，本发明提供了对具有至少一个反应性硫醇基的多肽进行修饰 (例如PEG化或糖基化）的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮 芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中 所述官能化试剂与聚（亚烷基二醇）分子（例如聚乙二醇（PEG)分子）或聚糖基团共价连 接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚（亚烷 基二醇）分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
[0017]除了使所述官能化试剂与所述多肽反应以将它们连接在一起的步骤之外，本发明 的方法还可包括一个或更多个步骤。例如，所述方法可包括使包含具有乙烯基取代基的含 氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚（亚烷基二醇）分子或聚糖基团反应以产生所述官 能化试剂的起始步骤。作为替代或者补充，所述方法可包括以下起始步骤：确定多肽中反应 性硫醇基的位置、选择用于与本发明官能化试剂反应的一个或更多个硫醇基、以及任选地 保护剩余硫醇基中的一些。然后可使所述多肽与本文所述的官能化试剂反应。通过上文应 当理解，所述乙烯基与所述多肽硫醇基的反应通常产生-CH2-CH2-S-基团，其使所述官能化 试剂与所述多肽共价连接。在该反应中产生的硫醚键在生物条件下通常非常稳定。该稳定 性可与现有技术中使用马来酰亚胺作为交联剂形成对比，使用马来酰亚胺作为交联剂具有 潜在缺点，当用其对多肽进行衍生化时，多肽在储存过程中发生反应，例如开环。
[0018]在其中所述多肽不包含合适的硫醇基或者所述多肽链的所期望位置中不包含合 适的硫醇基的本发明实施方案中，本发明可包括对母体多肽进行修饰的起始步骤，例如通 过化学反应或定点突变产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多 肽。优选地，这是通过用半胱氨酸残基替代所述多肽中一个或更多个氨基酸来实现的。在涉 及多肽糖基化的本发明实施方案中，可对所述母体多肽的天然糖基化位点进行修饰，例如 对天冬酰胺、苏氨酸或丝氨酸残基进行修饰，以引入之后可与包含一个或更多个聚糖基团 的官能化试剂反应的硫醇基。这是可以进行的，例如当母体多肽的该位点未糖基化时（例 如作为其所产生之方式的结果），或者当糖基化已被除去时。
[0019]作为替代或者补充，本发明方法可包括对与反应性硫醇基空间上接近的氨基酸 残基进行修饰以提高硫醇基对官能化试剂的反应活性。例如，可对空间上接近的氨基酸 残基进行修饰来改变所述反应性硫醇基周围的局部pH、氢键相互作用、水化（watersof hydration)、或空间可接近性。
[0020] 优选地，所述反应性硫醇基（不论其是天然存在于多肽中还被引入的）是半胱氨 酸氨基酸残基的一部分。
[0021]在进行上文所述的方法后，然后可在一个或更多个其它步骤中对所述PEG化或糖 基化多肽进行纯化或分离。
[0022] 在又一个方面中，本发明提供了下式所示的用于用聚（亚烷基二醇）或聚糖基团 对多肽进行官能化的化合物：
[0023]
【主权项】
1. 一种用于修饰具有至少一个反应性硫醇基的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽 与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与 所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚（亚烷基二醇）分子共价连接， 使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚（亚烷基二 醇）分子与所述多肽共价连接。
2. -种方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的 含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基 反应，其中所述官能化试剂与聚（亚烷基二醇）分子共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯 基取代基与所述多肽的所述硫醇基反应，从而使得所述聚（亚烷基二醇）分子与所述多肽 共价连接。
3. 权利要求1或权利要求2的方法，还包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环 的官能化试剂前体与所述聚（亚烷基二醇）分子反应来产生所述官能化试剂的初始步骤。 4?前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚（亚烷基二醇）分子是聚乙二醇（PEG) 分子。
5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述含氮芳香杂环是吡啶环、嘧啶环或叠氮环。
6. 前述权利要求中任一项的方法，还包括确定所述多肽中反应性硫醇基的位置，以及 任选地将其中的一些进行保护。
7. 前述权利要求中任一项的方法，还包括通过化学反应或通过定点突变以产生在所述 多肽的一个或更多个