冷冻保护试剂,冷冻保护和冷冻保存的组合物,其用途,和冷冻保存方法
【专利说明】冷冻保护试剂，冷冻保护和冷冻保存的组合物，其用途，和 冷冻保存方法
[0001] 本发明的领域
[0002] 本发明设及冷冻保护剂，冷冻保护试剂，冷冻保护组合物，冷冻保存组合物，其用 途，和冷冻保存方法。
[000引本发明的背景
[0004] 活的生物样品如细胞，组织或器官（其是已经从一个供体来源获得的）的冷冻保 存是在科学界和医学界非常重要的和具有很大实用性。冷冻保存通常是一个过程，其中样 品，例如细胞或组织，通过冷却到零度W下的温度，通常为77K( = -196°C，液态氮的沸点） 而被保存。在该些低温度下，任何生物活性，包括会引起细胞死亡的生化反应，有效地被阻 止了。冷冻保存技术通常用于长期保存含水或水性物质如植物和动物的细胞和组织。已知 的是，通过冷冻该些物质，冰晶形成，导致不均匀的溶质浓度和污染物被水分子排除在外， 称为"冷冻浓缩"。为了使细胞或组织被保存，冷冻保护剂的溶液通常是用来防止由于在冷 却期间的冻结或解冻过程导致的损伤。为了使冷冻保存是有用的，冷冻保存的样品应在采 集的时候保留它的完整性和生存力至合理的水平。因此，冷冻保存样品的过程本身优选不 严重破坏或毁坏，例如细胞或组织结构。
[0005] 在传统的冷冻技术，样品被采集，放置在存储溶液，然后冷冻保存。当样品被使用， 它被解冻，例如从人类供体来源取得的细胞被恢复到正常的人体温度（即，约37°C)然后被 放置在细胞培养基中。冷冻保存方案使细胞在整个细胞采集，冻结，解冻过程中经历多种应 力和损伤。该些应力和损伤，可W对细胞造成不可逆的损伤。
[0006] 葡聚糖已被用来作为人类，动物和植物细胞冷冻保护试剂（Odavic，R.et al.Experientia36，1122(1980)，Ashwood-Smith，M.J.etal.Cryobiology9,441(1972) andEchlin，P.etal.J.Microsc. (0xford) 110,239(1977))。5% 甲基亚讽和 9% 葡聚糖 70的混合物被发现为人骨髓定向干细胞提供了最佳冷冻保存值extran，Han化ook化om AmershamBioSciences，18-1166-12,AA版，35页）。针对单独或组合的葡聚糖，甘油和二 甲基亚讽（DMS0)进行了人骨髓细胞冷冻保护的研究（Odavic，R.等人。Experientia36， 1122(1980))。与采用15%的甘油或9%葡聚糖W及1%DMS0相比，通过9%葡聚糖70与3 或5%的DMS0的组合，W及单独的5或10%的DMS0,针对冷冻损害得到了显著优选的保护。 葡聚糖 40 是已知（Proc.Nati.Acad.Sci.USA,卷 92,10119-10122 页，1995 年十月，Medical Sciences)用于胎盘/厮带血冷冻保存，其为50%DMSO5% (w/v)在葡聚糖40中的组合。
[0007] ShuGuowei等人在AdvancedMaterialsResearch，TransTechPublications Ltd.，Vol. 328 (2012)，pp454-457中描述了，果糖寡糖，异麦芽糖寡糖，菊粉和低聚木糖在 冻干过程中对B.bifidium生存力的影响。KwanHwaPark等在Dat油aseCA，XP002698458 中描述了含有果糖寡糖，异麦芽糖寡糖、半乳糖寡糖的冷冻保护试剂用于鱼糜。在Korean Soc.化odSci.Nutr.，Vol. 30 (3) (2001)，PP565-568中介绍了，果糖寡糖，异麦芽糖寡糖和 半乳糖寡糖冷冻保护试剂对牛肉蛋白的影响。
[000引传统的冷冻保护剂是二醇（含至少两个哲基的醇），如己二醇，丙二醇，甘油。己二 醇通常用作汽车冷冻保护剂，丙二醇已被用来减少冰洪淋中冰的形成。二甲基亚讽值MSO) 也被视为一个传统的冷冻保护剂。甘油和DMS0已被低温生物学家使用了几十年W降低保 存在液氮中的精子和胚胎中的冰形成（-196°C)。在该些已知的冷冻保护试剂中，DMS0被认 为是最有效和最常用的，但它是生理毒性的，并且已知，如果DMS0与细胞一同被输给接受 者或处理DMS0的人员，DMS0引起高血压，恶屯、和呕吐，除非采取预防措施。Cox等人（Cell TissueBank(2012) 13:203-215)通过公开文献回顾的综述发现，几百不良反应（如恶屯、， 畏寒，屯、律失常，神经学症状和呼吸停止）与采用二甲基亚讽冷冻保护的干细胞移植相关。 此外，DMS0的毒性往往降低细胞生存力和/或功能，包括在解冻的细胞被培养或输入接受 者的躯体后基因组改变。DMS0的毒性从而也影响在处理过程中细胞可能暴露于DMS0的时 间。
[0009] 因此，仍然需要在冷冻过程中作为其他冷冻保护剂如DMS0的替代物或作为其他 冷冻保护剂的添加物的用于保护样品如生物样品的冷冻保护试剂，W及减少需要的浓度， 优选是减少至无毒浓度，同时所述冷冻保护试剂有必要的防护效果和毒性低。
[0010] 本发明的目的
[0011] 本发明实施方案的目的是，提供作为其他冷冻保护剂如DMS0的代替物或作为其 他冷冻保护剂的添加物的冷冻保护剂W降低其浓度，优选降低至无毒浓度，所述冷冻保护 剂在冷冻保存中针对保存冷冻保存的样品的原功能性具有必要的保护作用。本发明的实施 方案的进一步目的是，提供具有对处理冷冻保护剂的人员和对生物样品而言低毒性的冷冻 保护剂，由此延长样品可W与冷冻保护剂接触而不被损坏的时间，洗漆样品的必要性被降 低，并且优选，如果需要的话，在不将样品从冷冻保护剂分离的情况下，可能将样品返回至 所述样品被采集的地方，或将样品返回至接受者。本发明的实施方案进一步的目的是，提供 一种冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是有效的样品的冷冻保护剂，所述样品选自器官，细胞和 组织，如选自哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织。本发明的实施方案进一步的目 的是，提供一种冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是有效的将被进行移植的样品的冷冻保护剂， 所述样品例如器官，细胞或组织。本发明的实施方案进一步的目的是，提供一种冷冻保护 剂，所述冷冻保护剂是有效的例如细胞的冷冻保护试剂，和导致所述细胞可接受的生存力。 本发明的实施方案进一步的目的是，提供一种冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是有效的例如 器官的冷冻保护试剂，并且导致所述器官可接受的躯体功能。本发明的实施方案进一步的 目的是，提供一种冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是有效的例如组织的冷冻保护试剂，和导致 所述组织可接受的躯体功能。
[001引本发明的概要
[0013] 本发明人发现，如下的冷冻保护试剂作为冷冻保护剂是很有用的；包括一种或多 种冷冻保护剂的冷冻保护试剂，所述冷冻保护剂选自糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生 物，和a)所述冷冻保护试剂包括基于在所述试剂中糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生 物的总重量的至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦芽糖寡糖及 其衍生物具有300至1650化的重量平均分子量（M，)，或b)其中所述的冷冻保护剂有300 至9500化如300至7500化的重量平均分子量（MJ，或C)其中所述冷冻保护试剂包括基 于在所述试剂中糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总重量的至少1%w/w的一种或 多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的重量平 均分子量（M")，并且所述冷冻保护剂有300至9500化的重量平均分子量（M")。相比于W前使用的较高分子量的葡聚糖物质如葡聚糖40 (40000Da)和葡聚糖70 (70000化)，由于分 子量较低，包括上述的冷冻保护剂的冷冻保护试剂具有较低的粘度，因此可W在高浓度被 预先制备，使得可能添加已经在溶液中的样品，并且仍然获得包括在适于冷冻保存浓度的 冷冻保护试剂和样品的组合物。此外，低分子量的分子一般比具高分子量分子具有较低免 疫原性。葡聚糖1被称为半抗原抑制剂，其减少当给予葡聚糖时的过敏反应的风险，并因此 用作在注射高分子量葡聚糖如葡聚糖40(40000Da)和葡聚糖70(70000Da)前的预注射液。 葡聚糖 1 也被记录在Richter等人（（Int.Arch.Allergy43 ;252-268 (1972)和Int.Arch. Allergy41:826-844(1971))的研究中，在人类有非常低的免疫潜力。此外，实施例中已被 证明的是，与采用具有较高分子量的葡聚糖相比，采用本文描述的冷冻保护剂的冷冻保存 在冷冻保存后提供了对功能性优选的保护，如采用试验的细胞生存力所测定的。
[0014] 所W，在第一个方面，本发明设及，包括的一种或多种冷冻保护剂的冷冻保护试 剂，所述冷冻保护剂选自糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物，和
[0015]a)其中所述冷冻保护试剂包括基于糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总 重量的至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦芽糖寡糖及其衍生 物具有300至1650化的重量平均分子量（MJ，或
[0016]b)其中所述的冷冻保护剂有300至9500化如300至7500化的重量平均分子量 (MJ或，
[0017]C)其中所述冷冻保护试剂包括基于在所述冷冻保护试剂中糊精、葡聚糖、异麦芽 糖寡糖及其衍生物的总重量的至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述 异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的重量平均分子量（MJ，并且所述冷冻保护剂 具有300至9500化的重量平均分子量（MJ。
[0018] 在另一方面，本发明设及包括选自异麦芽糖寡糖及其衍生物的冷冻保护剂的冷冻 保护试剂，所述异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的，如850至1650化的重量平 均分子量（M，)。
[0019] 在另一方面，本发明设及本文中描述的冷冻保护剂在冷冻保存样品中的用途，其 中所述样品选自器官，细胞和组织。
[0020] 在另一方面，本发明设及包括如本文所述的冷冻保护试剂的冷冻保存组合物，所 述冷冻保存组合物进一步包括将被冷冻保存的样品，其中所述样品选自器官，细胞和组织。
[0021] 在另一方面，本发明设及包括如本文所述的冷冻保护试剂的冷冻保存组合物，所 述冷冻保存组合物还包括已被冷冻保存的样品，其中所述样品选自器官，细胞和组织。
[0022] 在另一方面，本发明设及冷冻保存样品的方法，包括如下步骤；使将被冷冻保存的 样品与如本文所述冷冻保护试剂接触，W获得冷冻保存组合物，和随后降低冷冻保存组合 物温度至冷冻保存温度，其中所述样品选自器官，细胞和组织。
[0023] 在另一方面，本发明设及，通过使组合物达到冷冻保存温度而冷冻保存本文所描 述的冷冻保存组合物的方法，。
[0024] 在另一方面，本发明设及本文所描述的冷冻保护试剂在冷冻保存样品中的用途， 其中所述样品选自器官，细胞和组织。
[00巧]在另一方面，本发明设及本文所描述的冷冻保护试剂在冷冻保存用于移植的样品 中的用途。
[0026] 在另一方面，本发明设及本文所描述的组合物在通过降低所述组合物温度至冷冻 保存温度而冷冻保存样品中的用途，其中所述样品选自器官，细胞和组织。
【附图说明】
[0027] 图1显示了，分别在W下中解冻后NHDF的生存和1次传代后NHDF生存力；1) 10% 的DMS0, 2) 8 %的异麦芽糖寡糖1 (ISOM)和2 %的DMS0, 3) 8 %的异麦芽糖寡糖1 (ISOM)和 4)DMBl如实施例2中所描述的。
[002引图2显示了，分别在W下中解冻后NHDFs的生存和1次传代后NHDFs生存力； 1) 10 %的DMS0,。8 %氨化异麦芽糖寡糖1 (H-IS0M)和2 %的DMS0,如8 %氨化异麦芽糖寡糖 UH-IS0M)和4)的DMBl，如实施例2中所描述的。
[0029] 图3显示了，分别在W下中解冻后畑EKs的生存和1次传代后畑EKs生存力； 1) 10%的DMS0J)8%的异麦芽糖寡糖l(ISOM)和2%的DMSO，：3)8%的异麦芽糖寡糖 1 (ISOM)和4)DMEM，如实施例3中所描述的。
[0030] 图4显示，分别在W下中解冻后畑EKs的生存；1)10%的DMS0J)8%氨化异麦芽 糖寡糖1 (H-IS0M)和2%的DMSO，：3)8%氨化异麦芽糖寡糖1 (H-IS0M)和4)DMEM，如实施例 3中所描述的。
[0031] 图5显示了，分别在W下中解冻后的MSCs的生存和1次传代后的MSCs的生 存；1)10%的DMS0,2)8%的异麦芽糖寡糖l(ISOM)和2%的DMS0,3)8%氨化异麦芽糖 寡糖l(H-ISOM)和2%的DMS0,4)8%的异麦芽糖寡糖1(IS0M)，5)8%氨化异麦芽糖寡糖 UH-IS0M)和6)DMai，如实施例4中所描述的。
[0032] 图6显示，分别在W下中解冻和冷冻保存后，在PluriPro生长培养基中的人类iPS 细胞的生存；生长培养基佑rowthmedium)+10%DMS0,生长培养基巧％的DMS0,生长培养 基+10%DMS0+2%的异麦芽糖寡糖l(ISOM)，生长培养基+10%DMS0+4%的异麦芽糖寡糖 l(ISOM)，生长培养基+10%DMS0+8%异麦芽糖寡糖l(ISOM)，生长培养基巧％DMS0+2%的 异麦芽糖寡糖1 (ISOM)，生长培养基巧％DMS0+4 %的异麦芽糖寡糖1 (ISOM)，生长培养基 巧％DMS0+8 %的异麦芽糖寡糖1 (ISOM)，生长培养基+2 %异麦芽糖寡糖1 (ISOM)，生长培养 基+4%异麦芽糖寡糖1 (ISOM)，生长培养基+8 %异麦芽糖寡糖1 (ISOM)和不含任何冷冻保 护剂的生长培养基，如实施例7中所描述的。
[0033] 图7显示，分别在W下中解冻后和冷冻保存后PluriPro生长培养基中的人类iPS 细胞的生存；生长培养基+10 %DMS0,生长培养基巧％的DMS0,生长培养基+10 %DMS0+2 % 氨化异麦芽糖寡糖1 (H-IS0M)，生长培养基+10%DMS0+4%氨化异麦芽糖寡糖1 (H-IS0M)， 生长培养基+10%DMS0+8%氨化异麦芽糖寡糖1 (H-IS0M)，生长培养基巧％DMS0+2%氨化 异麦芽糖寡糖UH-IS0M)，生长培养基巧％DMS0+4%氨化异麦芽糖寡糖l(H-ISOM)，生长 培养基巧％〇150+8%氨化异麦芽糖寡糖1化-1501)，生长培养基+2%氨化异麦芽糖寡糖 1化-1501)，生长培养基+4%氨化异麦芽糖寡糖1化-1501)，生长培养基+8%氨化异麦芽糖 寡糖l(H-ISOM)和不含任何冷冻保护剂的生长培养基，如实施例8中所述。
[0034] 图8显示了，分别在W下中解冻和增殖3天后MSCs的生存；1) 10 %的DMS0， 2) "CRY0"分别意指8 %异麦芽糖寡糖1，葡聚糖MwlO. 000或葡聚糖Mw40. 000,其各自 与5 %的DMSO组合，扣"CRYO"分别意指8%异麦芽糖寡糖1，葡聚糖MwlO. 000或葡聚 糖1巧40.000，其各自与1%0150组合，4)"0?￥0"分别意指8%异麦芽糖寡糖1，葡聚糖 MwlO. 000或葡聚糖Mw40. 000和5)DMBl培养基，如实施例9中进一步描述的。
[00巧]图9显示，分别在W下中解冻后MSCs生存；1) 10 %的DMS0, 2) 2 %的DMS0, 3) 8 % 的异麦芽糖寡糖Mwl500 (ISOM)和2 %的DMS0,4) 8 %的异麦芽糖寡糖Mwl500 (ISOM)，和5) DMEM，如实施例10中进一步说明的。
[0036] 图10显示了，用DMS0,异麦芽糖寡糖1或氨化异麦芽糖寡糖1冷冻保存后CD34+ 造血干细胞的生存力，如实施例11中进一步描述的。
[0037] 图11显示，采用DMS0,异麦芽糖寡糖1或氨化异麦芽糖寡糖1冷冻保存后脂肪来 源的基质/干细胞（ASC)的生存力，如实施例12中进一步描述的。
[0038] 本发明的详细公开 [003引定义
[0040] 如本文所使用的，冷冻保存意指一种方法，其中，通过冷却到零度W下的温度而保 存样品，包括玻璃化技术，在其中的冷却速度比传统的冷冻保存方法更快。在如此低的温 度，活性例如生物活性，包括会导致例如细胞死亡的生化反应被减少，例如蛋白/糖蛋白或 脂蛋白的化学结构/功能得W保存。如果不使用冷冻保护剂溶液，被保存的样品可能会被 损坏，其原因在于冷却或解冻过程中的冻结。
[0041] 在一个优选方面，冷冻保存意指如下方法，其中通过冷却到零度W下的温度，通常 为77K( =-196°c，液态氮的沸点）而保存样品。在该种低的温度，任何生物活性，包括会引 起细胞死亡的生化反应有效地被阻止。
[0042] 本文所使用的术语"冷冻保存温度"意指如下的温度；从零下到-196。如 从-50°C至-196 °C，如从-80°C至-196 °C，例如低于-55 °C，例如低于-60 °C，例如低 于-65 °C，例如低于-70°C，例如低于-75 °C，例如低于-80°C，例如低于-85 °C，例如低 于-90°C，例如低于-95°C，例如低于-100°C，例如低于-105°C，例如低于-110°C，例如低 于-115°C，例如低于-120°C