"冷冻 保存组合物"，其是在被冷冻保存的过程中或已经被冷冻保存。
[0161] 在本文公开的另一方面是一种冷冻保存的组合物，其包括用于要被冷冻保存的样 品的培养基或底物。
[0162] 在一方面，样品选自器官，细胞和组织例如哺乳动物。在另在一方面，样品是器官， 细胞，血液或组织。将被冷冻保存的该样的细胞实施例是体外培养细胞包括原代细胞，细胞 系，在体外分选的细胞包括人类血细胞，和动物和人类的来源的受精卵。进一步的实施例是 精子细胞，胚胎干细胞，IPS细胞，间充质干细胞，造血干细胞，神经干细胞，厮带血干细胞， 肝细胞，神经细胞，屯、肌细胞，血管内皮细胞，血管平滑肌细胞和血细胞。在另在一方面，样 品是选自W下的细胞；间充质干细胞，造血干细胞，胚胎干细胞，IPS细胞，角质形成细胞， 优选的造血干细胞例如CD34阳性血干细胞，间充质干细胞，胚胎干细胞和WS细胞。在另在 一方面，样品选自间充质干细胞和造血干细胞。在一方面，细胞是动物或人类来源的。器官 的实施例是肺，肝，肾，屯、脏，卵巢和膜腺。组织实例是如下的组织；骨髓，皮肤，卵巢，睾丸， 血管，结缔组织，优选的组织是卵巢和结缔组织。在另在一方面，血液是选自厮带血，和移动 的外周血，优选的厮带血。在另在一方面，样品是含有细胞的体液例如血，月经液或羊水。
[0163] 根据被冷冻保存的特定样品，在将被冷冻保存的组合物中存在的冷冻保护剂的量 通常是1至50%w/w如从2至50%w/w，如从4至45%w/w，或从6至20%w/w，或从6至 12%w/w，或者优选从6至10%w/w，或者最优选从7至9%w/w。在一个方面，将被冷冻保 存的组合物中存在的冷冻保护剂的量是至多60%w/w的量，例如W至多55%w/w的量，例 如W至多50%w/w的量，例如W至多45%w/w的量，例如W至多40%w/w的量，例如W至 多35%w/w的量。在另一方面，冷冻保护剂通常存在的量是至少2%w/w的量，例如W至少 4%w/w的量存在，例如W至少6%w/w的量存在，例如W至少6%w/w的量存在，例如W至 少7%w/w的量存在。
[0164] 如果要被冷冻保存的组合物包括额外的冷冻保护剂例如DMS0,冷额外的冻保护试 剂通常存在的量是少于8%w/w的量，如从1-8%w/w，例如例如，在低于5%w/w的量，例如 低于4%w/w如从1-4%w/w的量。
[0165] 在传统的冷冻保存技术中，样品是被采集，悬浮在存储溶液中，然后通过冷冻被保 存。当要使用样品例如细胞时，它们被解冻，例如，从人类供体来源取得的细胞被恢复到正 常的人体温度（即，约37°C)，然后被放入细胞培养基。
[0166] 在本冷冻保存方法中，样品在如下在冷冻保存期间被保护；在被冷冻至冷冻保存 温度之前，使所述样品与如本文所述的冷冻保护试剂接触。通过使其与冷冻保护试剂接触 是指，使样品W某种方式与冷冻保护试剂接触，从而在降低温度至冷冻保存温度的过程中， 通过在冷冻保存保护组合物中的冷冻保护剂保护所述样品。例如，可通过W下使细胞与冷 冻保护试剂接触：填充板适当的孔，所述将被保护的细胞被贴附在是孔中，将细胞悬浮在冷 冻保护试剂溶液中或将例如冷冻干燥形式的冷冻保护试剂添加至例如缓冲剂溶液中的细 胞，血液或器官，或将离屯、后的细胞颗粒重新悬浮在冷冻保护试剂中使细胞进入溶液等。
[0167] 在本文公开的一个方面是一种冷冻保存样品的方法，包括如下步骤；使将被冷冻 保存的样品与如本文定义的冷冻保护试剂接触，W获得冷冻保存组合物和随后减少冷冻保 存组合物的温度至冷冻保存温度。
[0168] 在另在一方面，本文公开的是一种通过降低该组合物温度至冷冻保存温度而冷冻 保存本文定义的组合物的方法。
[0169] 如果细胞对热休克敏感，从室温变化至低于溶液凝固点1-2°C的速度可能对最终 生存力具有主要影响。
[0170] 3. 5°C和-5°C之间，样品通常通过W下被引起冻结：引入冰晶体，用低温探针接触 介质表面，通过机械振动，或通过迅速降低温度至出现冰核。由于冷冻是一个放热过程，热 量必须从冷冻液导出。该可W通过W下实现：保持样品浸泡在具有低凝固点的液体中或通 过提供大量的散热装置。因为冰在细胞外介质中形成，越来越多的自由水变成在冰相中结 合。细胞膜是疏水的，作为胞内冰成核的屏障，因此解冻的细胞暴露于越来越高渗的溶液。 细胞外的盐的浓度增加，其原因在于水封存到冰中。解冻的细胞收缩，其原因在于水被运输 至细胞外，该是响应于细胞内和细胞外液相之间的渗透压失衡。然后W有限的速度冷却样 品，所述速度必须针对每个细胞类型而被优化。
[0171] 冷却的最佳速度是由W下确定的；细胞膜对水的通透性，细胞表面与体积的比，W 及在如本文所述的冷冻保护试剂中冷冻保护添加剂的类型和浓度。对于在甘油或DMS0冷 冻的大多数有核细胞，最佳的冷却速度通常是每分钟约0. 3到10°C之间。在约4°C至-80°C 之间的连续冷却是最常用的。一旦样品达到约-80°C，它可直接被递送入液氮（-196°C)或 液态氮的气相W用于储存。另一种用于冷冻保存的方法是玻璃化冷冻技术，其中可W获得 1000°C-2000°C/分的非常快的冷却速度。采用该一技术，包含冷冻保存组合物与样品的专 业化玻璃化设备被直接放入液氮。在一个方面，冷冻保存温度W如下速度达到；〇. 05-15,例 如0. 1-10,例如0. 2-8,例如0. 3-6,例如0. 4-4,例如0. 5-2°C每分钟。在另一方面冷冻保存 温度是W如下速度达到；500-3000,例如800-2500,例如1000-2000,例如1200-1800°C每分 钟。
[0172] 在液氮温度的活细胞储存的时间是主要依赖于宇宙射线背景引起的自由基生成 速度。
[0173] 例如，存在液氮中的哺乳动物的胚胎保半衰期估计为约30000年。重要的是，不要 让冷冻细胞升温高于它们的贬存温度，即使短暂的时间也不行。间歇升温促进快速迁徙的 重结晶，它可W破坏细胞结构和降低整体生存力。
[0174] 在另在一方面，冷冻保存后解冻样品。样品的解冻最佳速度取决于使用的冷冻条 件和要保存的特定样品。一般来说，对冻结于悬浮液中的单细胞，和组织例如屯、脏瓣膜，快 速升温速率是可取的。如此迅速的升温限制冰晶在冷冻的样品中生长，并且往往是高生存 力的绝对必要条件。对于许多组织该种升温可W通过在37~42°C水浴揽拌样品而完成。 快速升温的原理是，它限制了在冷却过程中形成的冰晶生长。
[01巧]一些组织可能会对迅速升温是敏感的。该是因为短暂的渗透压冲击，因为细胞暴 露于细胞外高渗溶液，随着冰的融化而被迫再水合W维持渗透压平衡。对于其他的，更灵敏 的，样品，代谢过程可W通过在解冻培养基中使用血清或其他高分子量聚合物的连续稀释， 被再活化，或带到正常水平。
[0176] 在解冻的过程完成后，细胞仍然暴露于多体积克分子浓度的冷冻保护试剂，所述 冷冻保护试剂必须逐步被稀释W使细胞返回等渗介质（培养基）。对于哺乳动物细胞，逐步 稀释方案通常被使用。样品的稀释通常是优选在37°C被执行，W减少渗透压冲击和冷冻保 护剂毒性的影响。在另在一方面，所述冷冻保护剂浓度是从4至45%w/w，如从4至20% w/w，如从5至15%w/w，或从6至12%w/w，或者优选从6至10%w/w，或者更优选从7至 9%w/w冷冻保护剂。
[0177] 在另在一方面，在冷冻保存组合物中样品的温度被降低到低于-50°C，例如-50°C 至-196°C，例如-80°C至-196°C的冷冻保存温度。
[017引在一个方面，冷冻保护试剂被用于储存方法。在一个方面，冷冻保护试剂被用于临 床的储存方法。在一个方面，冷冻保护试剂被用于移动的外周血储存方法。
[0179] 在一个方面，冷冻保护试剂被用于临床的储存方法中例如在用于治疗恶性疾病的 干细胞移植中或器官移植中。在一个方面，冷冻保护试剂被用于移动的外周血储存方法，骨 髓储存方法或厮带储存方法。
[0180] 在一个方面，冷冻保护试剂被用于骨髓储存方法或厮带储存方法。在一个方面，冷 冻保护试剂被用于脂肪组织储存的方法或牙髓组织储存方法。在另在一方面，冷冻保护试 剂被用于繁殖储存方法。
[0181] 在进一步的实施方案中被公开如下：
[0182] 1.冷冻保护试剂，其包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是W下的一种或多种：糊 精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物，例如是一种或多种；葡聚糖，异麦芽糖寡糖，和它们 的衍生物，和
[0183]a)其中基于在所述试剂中糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总重量，所述 冷冻保护试剂包括至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物和/或
[0184]b)其中所述的冷冻保护剂有300至9500化的重量平均分子量（MJ。
[01财 2.冷冻保护试剂，包括一种或多种的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糊精、葡聚 糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物，例如选自葡聚糖，异麦芽糖寡糖，和它们的衍生物，和
[0186]a)其中基于在所述冷冻保护试剂中的糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的 总重量，所述冷冻保护试剂包括至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述 异麦芽糖寡糖及其衍生物具有如下的重量平均分子量（MJ;300至l，650Da，或
[0187]b)其中所述的冷冻保护剂有300至9500化的重量平均分子量（M，)，或
[018引C)其中基于在所述冷冻保护试剂中的糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的 总重量，所述冷冻保护试剂包括至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述 异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的重量平均分子量（MJ，所述冷冻保护剂具有 300至9500化的重量平均分子量（MJ。
[0189] 3.根据实施方案1-2任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有300至7500化的 重量平均分子量（M，）。
[0190] 4.根据实施方案1-3任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂是选自异麦芽糖寡糖 及其衍生物的一种或多种，所述异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650的重量平均分子 量（MJ。
[0191] 5.根据实施方案1-4任何一项的试剂，其中基于在所述冷冻保护试剂中的糊精、 葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总重量，所述冷冻保护剂包括至少1%w/w的一种或多 种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的重量平均 分子量（MJ。
[0192] 6.根据实施方案1-5任何一项的试剂，其中所述异麦芽糖寡糖及衍生物具有850 至1650化的重量平均分子量（MJ。
[0193]7.根据实施方案1-6任何一项的用于冷冻保存样品的试剂，并且所述样品选自器 官，细胞和组织例如选自哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织。
[0194] 8.根据实施方案1-7任何一项的用于冷冻保存样品的试剂，其中所述样品是用于 移植。
[0195] 9.根据实施方案1-8任何一项的用于冷冻保存样品的试剂，其中所述样品是在冷 冻后具有功能。
[0196] 10.实施方案1-9任何一项的试剂，其中所述样品是器官，所述器官在冷冻保存后 具有功能，如通过所述器官的生理功能所测量的，和/或其中所述样品是组织，所述组织具 有功能，如由该样的组织与周围组织整合能力所测量的和/或所述样品是细胞，所述细胞 具有功能，如由冷冻保存后所述细胞的生存力所测量的。
[0197] 11.根据实施方案1-10的任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有1，650至 7, 500化的重量平均分子量（M,)。
[0198] 12.根据实施方案1-11任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有500至 3, 500化的重量平均分子量（M,)。
[0199] 13.根据实施方案1-12任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有如下的重量平 均分子量（M,) ;1, 650 至 3, 500Da。
[0200] 14.根据实施方案1-13任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有多分散性Pd， 其中Pd是> 1和《5。
[0201] 15.根据实施方案1-14任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有如下的重量平 均分子量（M,) ;850 至 1, 650Da。
[0202] 16.根据实施方案1-15任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有如下的重量平 均分子量（M,) ;850 至 1, 150Da。
[020引17.根据实施方案1-16任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂具有多分散性Pd， 其中Pd是> 1和《3。
[0204] 18.根据实施方案1-17任何一项的试剂，基于在所述试剂中环糊精，葡聚糖，异麦 芽糖寡糖及其衍生物的总重量，所述试剂包括至少10%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及 其衍生物。
[0205] 19.根据实施方案1-18任何一项的试剂，其中所述具有少于3个葡萄糖单元的异 麦芽糖寡糖的重量分数是少于15%w/w。
[0206] 20.根据实施方案1-19任何一项的试剂，其中有超过9个葡萄糖单元的异麦芽糖 寡糖的重量分数少于20%w/w。
[0207] 21.根据实施方案1-20任何一项的试剂，其中有少于3个葡萄糖单元的异麦芽 糖寡糖的重量分数为少于15%和有多于9个葡萄糖单元的异麦芽糖寡糖的重量分数少于 20%w/w例如少于15%w/w，例如少于10%w/w。
[020引 22.根据实施方案1-21的任何一项的试剂，基于在所述试剂中环糊精，葡聚糖，异 麦芽糖寡糖及其衍生物的总重量，所述试剂包括至少30%w/w，至少40%w/w，至少50%w/W，至少60%w/w，至少70%w/w，至少80%w/w，至少90%w/w，至少95%w/w或更多的一种 或多种异麦牙糖碁糖及其衍生物。
[0209] 23.根据实施方案1-22任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂是异麦芽糖寡糖， 异麦芽糖寡糖具有例如如下的重量平均分子量（M,) ;850至1, 150Da。
[0210] 24.根据实施方案1-23任何一项的试剂，其中所述异麦芽糖寡糖及其衍生物是基 于葡聚糖的。
[0211] 25.根据实施方案1-24任何一项的试剂，其中所述衍生物是糊精葡聚糖，和异麦 芽糖寡糖的衍生物，和选自氨化的异麦芽糖寡糖，氨化的葡聚糖，氨化的糊精，氧化的异麦 芽糖寡糖，氧化的葡聚糖，氧化的糊精，糊精的醋，葡聚糖的醋，异麦芽糖寡糖的醋，糊精的 離，葡聚糖的離，异麦芽糖寡糖的離，部分氨化/氧化的糊精，部分氨化/氧化的葡聚糖和部 分氨化/氧化的异麦芽糖寡糖，及其衍生物例如选自氨化的异麦芽糖寡糖，氨化的葡聚糖， 氨化的糊精，氧化的异麦芽糖寡糖，氧化的葡聚糖，氧化的糊精，DEAE-糊精，DEAE-葡聚糖， DEAE-异麦芽糖寡糖，駿基。_1。烷基-糊精，駿基C1_1。烷基-葡聚糖，駿基C1_1。烷基-异麦 芽糖寡糖，糊精的醋，葡聚糖的醋和异麦芽糖寡糖的醋，及其衍生物。
[0212] 26.根据实施方案1-25任何一项的试剂，其中所述衍生物是氨化的异麦芽糖寡 糖，氧化的异麦芽糖寡糖，DEAE-异麦芽糖寡糖，駿基。_1。烷基氧化的异麦芽糖寡糖或駿基 。_1。烷基异麦芽糖寡糖。
[0213] 27.根据实施方案1-26任何一项的试剂，其中所述衍生物是氨化的异麦芽糖寡糖 衍生物，例如具有如下的重量平均分子量（MJ的氨化的异麦芽糖寡糖；850至1，150Da。
[0214] 28.根据实施方案25-27任何一项的试剂，其中所述駿基Ch。烷基异麦芽糖寡糖 是駿甲基异麦芽糖寡糖或駿己基异麦芽糖寡糖。
[0215] 29.根据实施方案1-28任何一项的试剂，选自至少一种额外的冷冻保护剂选自己 酷胺，琼脂，海藻酸盐或醋，1-苯胺（analine)，白蛋白，醋酸锭，了二醇，硫酸软骨素，氯仿， 胆碱，二甘醇，二甲基己酷胺，二甲基甲酯胺，二甲基亚讽值MS0)，赤薛糖醇，己醇，己二醇， 甲酯胺，葡萄糖，甘油，a-甘油磯酸盐或醋，单己酸甘油，甘氨酸，哲己基淀粉，肌醇，乳糖，氯 化儀，硫酸儀，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲基己酷胺，甲基甲酯胺，甲基脈，苯酪，普流 巧克（Pluronic)多元醇，聚己二醇，聚己締化咯烧酬，脯氨酸，丙二醇，化晚N-氧化物，核 糖，丝氨酸，漠化钢，氯化钢，舰化钢，硝酸钢，硫酸钢，山梨糖醇，庶糖，海藻糖，=甘醇，己酸 =甲基胺，脈，鄉氨酸和木糖。
[0216] 30.根据实施方案1-29任何一项的试剂，其中所述额外的冷冻保护剂是DMS0。
[0217] 31.根据实施方案1-30任何一项的试剂，其中所述试剂基本不含DMS0。
[0引引 32.根据实施方案31的试剂，其不含DMS0。
[0219]33.根据实施方案1-32任何一项的试剂，包括实施方案1中定义的冷冻保护剂作 为唯一的冷冻保护剂。
[0220] 34.根据实施方案1-33任何一项的试剂，该试剂为粉末形式。
[0221] 35.根据实施方案1-34任何一项的试剂，该试剂为冻干或喷雾干燥粉末的形式。
[0222] 36.根据实施方案1-35任何一项的试剂，该试剂是溶液的形式。
[0223] 37.根据实施方案1-36任何一项的试剂，该试剂包括从30 %到