70%w/w的所述冷 冻保护剂，如40 %至65%w/w或50 %至60%w/w的所述冷冻保护剂。
[0224] 38.根据实施方案1-37任何一项的试剂，该试剂包括从30 %到70%w/w的所述额 外的冷冻保护剂，如从40 %到65%w/w或从50 %至60%w/w的所述额外的冷冻保护剂。
[0225] 39.根据实施方案1-38任何一项的试剂，还包括用于将被冷冻保护的样品的生长 培养基或底物。
[0226] 40.根据实施方案1-39任何一项的试剂，还包括属于lAPs(调亡抑制剂）的任何 蛋白，rho相关蛋白激酶（ROCK)信号通路抑制剂，和/或任何生长因子例如EGF，FGF，PDGF， IGF,EP0,BDNF，TGF，TNF和 / 或VEGF。
[0227] 41.根据实施方案1-40任何一项的试剂，还包括人类，牛，马或犬来源的任何血清 成分。
[022引 42.根据实施方案1-41任何一项的试剂，其中所述冷冻保护剂是无菌的。
[0229] 43.包括在实施方案1-42任何一项中定义的冷冻保护试剂的冷冻保存组合物，其 中冷冻保存组合物进一步包括将被冷冻保存的样品。
[0230] 44.根据实施方案43的冷冻保存组合物，其中所述样品选自器官，细胞例如分离 的细胞或含有细胞的体液例如血液和组织。
[0231] 45.根据实施方案44的冷冻保存组合物，其中样品选自哺乳动物器官，哺乳动物 细胞，和哺乳动物的组织，例如样品选自用于移植的哺乳动物器官，哺乳动物细胞，和哺乳 动物的组织。
[0232] 46.根据实施方案43-45任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品是选自W下 的细胞；体细胞，包括各种组织来源的细胞例如间充质干细胞，组织特异性祖细胞，角质形 成细胞，成纤维细胞，软骨细胞，骨细胞，或屯、肌细胞，血衍生的细胞例如造血干细胞，巨瞻 细胞，血小板（plate),红细胞，或干细胞，包括所有类型的多（潜）能细胞，全（潜）能细胞 和单（潜）能细胞，和胚层细胞。
[0233] 47.根据实施方案43-46任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品是选自W下 的细胞；角质形成细胞，成纤维细胞，间充质干细胞，巨瞻细胞，和造血干细胞，例如CD34阳 性造血干细胞。
[0234] 48.根据实施方案43-45任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品是选自W下 的组织：卵巢组织，睾丸组织，厮带组织，胎盘组织，结缔组织，屯、脏组织，来源于肌肉，骨和 软骨组织的组织，内分泌组织和神经组织。
[0235] 49.根据实施方案43-45任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品是选自W下 的含有细胞的体液；血例如厮带血，外周血，和移动的外周血，羊水，精液，脑脊液，月经液血 和骨髓穿刺物。
[0236] 50.根据实施方案43-45任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品是选自W下 的器官：肺，屯、脏，肾脏，肝脏，厮带和卵巢。
[0237] 51.根据实施方案43-45任何一项的冷冻保存组合物，其包括所述冻保护剂的量 为1至50%w/w如从2至50%w/w，或从4至45%w/w，或从6至12%w/w，或者优选从6 至10 %w/w，或者最优选从7至9 %w/w。
[0238] 52.根据实施方案43-51任何一项的冷冻保存组合物，其中所述组合物包括DMS0， 所述DMS0的量少于8%w/w，如1-8%。
[0239] 53.根据实施方案43-52任何一项的冷冻保存组合物，其中所述样品在冷冻保存 后具有功能。
[0240] 54.根据实施方案43-53中的任何一项的冷冻保存组合物，其中所述组合物包括 DMS0,所述DMS0的量少于8%w/w，少于4%w/w如1-4%。
[0241] 55.冷冻保存样品的方法，包括如下步骤：使将被冷冻保存的样品与在实施方案 1-42任何一项中定义的冷冻保护试剂接触，从而获得冷冻保存组合物，和随后降低冷冻保 存组合物的温度至冷冻保存温度。
[0242] 56.根据实施方案55的方法，其中冷冻保存组合物如在实施方案43-54任何一项 中所定义。
[0243] 57.冷冻保存实施方案43-56任何一项定义的组合物的方法，所述方法通过降低 所述组合物温度至冷冻保存温度冷冻而保存实施方案43-56任何一项定义的组合物。
[0244] 58.根据实施方案55-57中任何一项的方法，其中冷冻保存温度通过W下速度达 至IJ;0. 05-15,例如 0. 1-10,例如 0. 2-8,例如 0. 3-6,例如 0. 4-4,例如 0. 5-2°C每分钟。
[0245] 59.根据实施方案55-58任何一项的方法，其中所述冷冻保护剂的浓度是从4至 20 %w/w如从5至15 %w/w，或从6至12 %w/w，或者优选从6至10 %w/w，或者更优选从 7 至 9%w/w。
[0246] 60.根据实施方案55-59任何一项的方法，其中在冷冻保存组合物中样品的温度 降低到低于-50°C的温度，例如-50°C至-196°C，例如-80°C至-196°C。
[0247] 61.根据实施方案55-60任何一项的方法，其中样品在冷冻保存后被解冻。
[024引62.根据实施方案55-61任何一项的方法，其中所述样品在冷冻保存后具有功能。[0249] 63.根据实施方案55-62任何一项的方法，其中将被冷冻保存的样品选自器官，细 胞和组织。
[0巧0] 64.根据实施方案55-63任何一项的方法，其是临床的储存方法。
[0巧1] 65.根据实施方案55-64任何一项的方法，其是储存的方法例如移动的（转移的 (mobilized))外周血储存方法，骨髓储存方法，脂肪组织储存方法，牙髓组织储存方法，繁 殖储存方法或厮带储存方法。
[0252] 66.包括一种或多种冷冻保护剂的冷冻保护试剂在冷冻保存样品中的用途，其中 所述样品选自器官，细胞和组织，所述冷冻保护剂选自糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍 生物，例如选自葡聚糖，异麦芽糖寡糖，及其衍生物；和a)基于在所述冷冻保护试剂中的糊 精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总重量，所述冷冻保护试剂包括至少1%w/w的一 种或多种异麦芽糖寡糖和其衍生物，所述异麦芽糖寡糖和其衍生物具有300至1650化的重 量平均分子量（M，)，或b)其中所述的冷冻保护剂有300至9500化的重量平均分子量（MJ， 或C)其中基于在所述冷冻保护试剂中的糊精、葡聚糖、异麦芽糖寡糖及其衍生物的总重 量，所述冷冻保护试剂包括至少1%w/w的一种或多种异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦 芽糖寡糖及其衍生物具有300至1650化的重量平均分子量（M，)，所述冷冻保护剂具有300 至9500化的重均摩尔分子量（MJ。
[0巧引 67.根据实施方案66的冷冻保护试剂的用途，其中，所述冷冻保护剂具有300至 7500化的重量平均分子量（M,)。
[0254] 68.冷冻保护试剂在冷冻保存样品中的用途，所述样品选自器官，细胞和组织，所 述冷冻保护试剂选自异麦芽糖寡糖及其衍生物，所述异麦芽糖寡糖及其衍生物具有300至 1650化的重量平均分子量（MJ例如具有850至1650化的重量平均分子量（MJ，。
[0巧5] 69.在实施方案1-42任何一项定义的冷冻保护试剂在冷冻保存样品中的用途，所 述样品例如选自器官，细胞，和组织的样品。
[0巧6] 70.根据实施方案66-69任何一项的用途，包括使所述要被冷冻保存的样品接触 所述试剂，w获得冷冻保存组合物，和随后降低冷冻保存组合物的温度至冷冻保存温度。[0257] 71.实施方案43-54任何一项定义的冷冻保存组合物在冷冻保存样品中的用途， 其中通过降低所述组合物温度至冷冻保存温度而冷冻保存样品。
[025引 72.根据实施方案66-71任何一项的用途，其中冷冻保存温度通过W下速度达到： 0. 05-15,例如 0. 1-10,例如 0. 2-8,例如 0. 3-6,例如 0. 4-4,例如 0. 5-2°C每分钟。
[0巧9] 73.根据实施方案66-72任何一项的用途，其中所述冷冻保护剂的浓度是从4至 20%w/w如从5至15%w/w，或从6至12%w/w，或者优选从6至10%w/w，或者更优选从 7至9%w/w的冷冻保护试剂。
[0260] 74.根据实施方案66-73.任何一项的用途，其中冷冻保存组合物样品的温度降低 到低于-50温度°C，例如-50°C至-196°C，例如-80°C至-196°C。
[0261] 75.根据实施方案66-74任何一项的用途，其中样品在冷冻保存后被解冻。
[0262] 76.根据实施方案66-75任何一项的用途，其中所述样品在冷冻保存后具有功能，
[0263] 77.根据实施方案66-76中任何一项的用途，其中将被冷冻保存的样品选自用于 移植的器官，细胞，和组织。
[0264] 78.根据实施方案66-77任何一项的用途，其是在储存的方法中，例如移动的外周 血储存方法，骨髓储存方法，脂肪组织储存方法，牙髓组织的储存方法，繁殖储存方法或厮 带储存方法。
[0265] 79.根据实施方案66-78任何一项的用途，其是临床的储存方法。
[0266] 在上述说明中提到的所有出版物都通过引用并入本文。上述本发明的组合物，方 法和系统的各种修改和变化将在不脱离本发明的范围和精神的情况下对于是那些技术人 员而言是明显的。虽然本发明已在特定的优选实施方案中被描述，但是，应当理解，本发明 所要求保护的不应过分被限制于具体实施方案。
[0267] 制备实例1
[026引异麦芽糖寡糖1的制备
[0269] 低分子量葡聚糖的水解
[0270] 从膜收集作为渗透物的3345kg水解的葡聚糖，所述膜具有< 5000道尔顿的截止 值，所述葡聚糖在抑1. 5在95°C的温度被水解。
[0271] 水解是用凝胶渗透色谱（GPC)通过色谱监测，并当满足W下条件时通过冷却终止 水解；被水解的物质的分子量被估计已经达到了预期值，即重量平均分子量850-1150道尔 顿。
[0272] 通过水解低分子量异麦芽糖寡糖是被制备，也形成了葡萄糖。冷却中和后，葡萄糖 的含量和非常低分子量的低聚物通过膜过程被减少，所述膜有340-800道尔顿截止值。在 该个过程后，异麦芽糖寡糖含量由旋光测定值a20~200)为915公斤，并且还原糖的量是 用Somog}d试剂确定为22. 5 %。
[0273] 表1 ;来自GPC分析的结果。
[0274]
[0275]AUPW;峰下面积（Mj[027引AUPN;峰下面积（M。）
[0277] 从上述表1可见，异麦芽糖寡糖有1020化的丽，Mn为827Da，给出多分散性Pd = 1.23。还原糖测定为22. 5%。该种异麦芽糖寡糖在本申请中又称为五异麦芽糖。
[027引制备实施例2
[0279] 氨化异麦芽糖寡糖1的制备
[0280] 水解分离后得到异麦芽糖寡糖418公斤。还原糖被测定为30. 8%。采用10公斤棚 氨化钢处理该一数量，结果，在最后的离子交换前产生362公斤异麦芽糖寡糖。此后的溶液 被中和到抑< 7. 0,并随后去离子化，最后喷雾干燥。最终产物的还原糖被测量是0. 09%。
[0281] 表2 ;从GPC分析的结果。
[0282]
[0283]AUPW;峰下面积（Mj
[0284]AUPN;峰下面积（M。）
[0285] 从上面的表2可见，异麦芽糖寡糖具有968化的Mw，Mn为780Da，给出多分散性Pd =1.24。该种氨化异麦牙糖碁糖在本申请中也被称为五异麦牙糖巧。
[0286] 实施例1
[0287] 冷冻保存试剂的制备
[028引在下列实施例中使用的冷冻保存试剂如下制备；通过无菌溶解所述冷冻保护剂 (例如DMS0,如在制备实例1中所述而制备的五异麦芽糖（异麦芽糖寡糖1)或如在实施实 施例2中所述而制备的五异麦芽糖巧（氨化的异麦芽糖寡糖1))在生长培养基值MEM/F12 培养基+10%FBS+青霉素/链霉素）中，至所需的终浓度（例如，8%异麦芽糖寡糖1冷冻 保存组合物，8克至100毫升培养基）和过滤灭菌个别冷冻保存组合物。
[0289] 实施例2
[0290] 正常人皮肤成纤维细胞（NHD巧的冷冻保存；
[0291]NHDF(传代2)在常规T烧瓶中在标准条件下（37°C，5%C02和标准生长培养基 [DMEM/F。+10%FBS+青霉素/链霉素）])被培养。当达到汇合（70-80%)时，细胞群从烧 瓶中释放并且离屯、（1000巧m/10分）。0,5xl06细胞被重新悬浮在六种不同的冷冻保存剂 (1毫升）；1)生长培养基+10%的DMS0,2)培养基+2%DMS0+8%异麦芽糖寡糖1，3)生长 培养基+2%DMS0+8%氨化的异麦芽糖寡糖1，4)生长培养基+8%异麦芽糖寡糖1，5)生长 培养基+8%氨化的异麦芽糖寡糖1和6)生长培养基中不含任何添加剂值MEM/F12无FB巧。 然后在使用基于异丙醇的方法的标准控制的冷冻保护条件下将细胞冷冻保存，在恒定的速 率rc/分钟冷冻下降到液氮温度。一周后使用标准解冻方案解冻细胞（直接浸入水浴中 的小瓶，37度和将细胞液逐滴转移入新鲜37°C生长培养基中）。解冻后进行跟踪分析；1) 生存力，用核计数器设备（NC200)，和2)1次传的代生存力使用核计数器设备（NC200)。结 果视于图1和2,总结在表3-5。
[0292] 当使用异麦芽糖寡糖1作为唯一的冷冻保护试剂时，与使用10%的DMS0标准条件 相比，解冻后的生存力略有减少。当使用2%的DMS0和异麦芽糖寡糖1时，关于生存力没有 观察到差异。采用独自的异麦芽糖寡糖1冷冻保护的细胞在1次传代的生存力类似于使用 10%的DMS0的标准条件。该个实验表明，在使用异麦芽糖寡糖1为唯一冷冻保存剂的冷保 存溶液中冷冻保存NHDF，导致可WW与标准冷冻保存条件相同的程度使用的培养。
[0293] 实施例3
[0294] 正常人表皮角质形成细胞的冷冻保存（NHEKs):
[0295] 使用与如实施例2中所描述的相同的方案，冷冻保存NHEKs。相同的实验组被包 括。结果在图3-4中显不，总结于表3-5。
[0296] 如也对NHDF示出的，结果清楚地表明，NHEKs可W在使用异麦芽糖寡糖1作为唯 一的冷冻保护剂的冷冻保存溶液中被冷冻保存。在培养第1次传代的生存力的水平是与在 使用10%的DMS0标准条件冷冻保存的NHEKs的水平相同。
[0297] 实施例4
[029引正常人间充质干细胞OiMSCs)的冷冻保存：
[0299] 使用与如实施例2中所述相同的方案，冷冻保存间充质干细胞，有两个实验组被 包括，生长培养基+8%异麦芽糖寡糖1+2%海藻糖和生长培养基+2%海藻糖。利用核计数 器技术，进行生存力分析，如上面描述的。结果显示在图5和总结在表3-5。
[0300] 结果清楚地表明，间充质干细胞（hMSCs)可W在使用异麦芽糖寡糖化作为唯一的 冷冻保护剂的冷冻保存溶液中被冷冻保存。解冻后的生存力是与含10%的DMS0标准制剂 在在同一水平。
[0301]表 3-5;
[0302]T1;解冻后的生存
[0303]T2;1次传代后的生存
[0304]
[0307]表 4[030引
[030引表5
[0310]实施例5
[031。hMSCs暴露于异麦芽糖寡糖1
[031引hMSCs在常规T烧瓶中生长至汇合。细胞被释放，悬浮在两种不同制剂中1)生长 培养基+10 %的DMS0和2) 8 %异麦芽糖寡糖1。每个制剂的细胞终浓度为lxl06/毫升细 胞。使用的是如实施例2中所描述的相同的基本方案。来自每一小瓶的1毫升被加入冷 冻小瓶中，生存力在S个不同的时间点用核计数器分析；1)0分钟（TO)，10分钟（T10)和 30min(T30)。结果总结在表6。
[031引
防314] 表6
[03巧]它清楚地表明，暴露于标准冷冻保存条件严重影响hMSCs生存力。暴露于含有异 麦芽糖寡糖1作为唯一的冷冻保护剂成分的冷冻制剂仅仅在暴露60分钟后影响显著生存 力。该表明，可能的是，在含异麦芽糖寡糖1的冷冻保存组合物中处理用于冷冻保存的细胞 培养，使得更灵活的工作程序成为可能。
[0316] 实施例6
[0317] 异麦芽糖寡糖560化用于冷冻保存hMSCs
[031引使用与如实施例2中所描述的相同的基本方案，冷冻保存人间充质干细胞OiMSCs)，采用相同的实验组。结果表明，可W的是，在异麦芽糖寡糖560Da中冷冻保存 hMSCs,然而在该个实验中氨化的异麦芽糖寡糖560化不如异麦芽糖寡糖560化一样有效。 结果总结在表7。
[0319]
[0320]表7
[0321] 实施例7
[0322] 在PluriPro生长培养基中的人iPS细胞
[0323] 在该个实施例中使用的异麦芽糖寡糖1是如制备实例1所描述的