不含选择性标志的克隆的非人类动物的制作方法
【专利说明】不含选择性标志的克隆的非人类动物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是2012年11月28日提交的US 61/730，771的非临时申请，US 61/730, 771出于所有目的以全文引用的方式并入。
技术领域
[0003]本发明提供了不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物。本发明提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过遗传工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中表达。本发明提供了用于产生不含选择性标志和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的组合物和方法。
【背景技术】
[0004]遗传修饰技术，例如转基因、敲入、敲除、插入诱变以及缺失，不可避免地需要在宿主基因组中插入选择性标志基因以确认成功的遗传修饰。然而，保留在宿主基因组中的选择性标志基因在已经确认了成功的遗传修饰之后就变得多余并且对于来源于含有选择性标志的动物的产物的使用可能引起安全问题。
[0005]出于这些原因，已经作出许多努力以在遗传修饰之后从宿主细胞或宿主动物中去除选择性标志和重组酶基因。举例来说，经由例如显微注射、转染或通过使用病毒粒子转导将重组酶基因引入ES细胞或受精卵子中，以去除侧接有重组位点(例如，1xP或FRT)的选择性标志基因。或者，将携带选择盒的动物育种为表达位点特异性重组酶的缺失品系以达到相同的效果。然而，这些技术具有许多缺点，包括在ES细胞中低水平的转染效率；由于延长的试管内培养所致的ES细胞多能性下降；以及需要附加的人力和财政资源用于额外的育种步骤。
[0006]因此，需要用于从经过遗传修饰的动物中有效地去除选择性标志和重组酶基因的组合物和方法。
【发明内容】
[0007]提供了用于产生不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的组合物和方法。
[0008]提供了不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物，例如小型猪和母牛，其中经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的基因组已经从体细胞(例如，成纤维细胞)中转移，这种体细胞经过工程改造以包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒含有可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因。ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶在未分化的多能干细胞中，例如在囊胚期胚胎的内细胞团中的ES细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)中转录，而不在分化的体细胞中转录。因此，在遗传修饰期间已经引入的选择性标志基因和重组酶基因可以在克隆胚胎发育期间从多能干细胞的基因组中去除。
[0009]提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过遗传修饰以含有可自切除的重组酶表达构筑体，其中这些体细胞包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种构筑体上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得重组酶基因可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞(例如，ES细胞)中而不在分化的体细胞中表达。通过将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中或转移至多能干细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)中，选择性标志和重组酶基因可以从发育中的克隆胚胎中的多能干细胞中去除，或从任何多能干细胞中去除，包括重编程为多能(例如，诱导多能(iPS细胞))的体细胞。
[0010]提供了产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的方法，其中这种方法包括:(a)将核酸构筑体引入非人类动物的分化的体细胞中以产生经过遗传修饰的基因组；(b)将(a)的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中；(C)融合并活化(b)的卵母细胞以形成人工受精卵；(d)在试管内培养(C)的人工受精卵直至受精卵发育至囊胚胚胎期；以及(e)将(d)的囊胚植入代孕母体的子宫中以形成不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物，其中这种核酸构筑体包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中转录。因此，将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中并且使人工产生的受精卵发育成胚胎之后，选择性标志和重组酶基因就从发育中的克隆胚胎中的多能干细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)的基因组中去除。以这种方式，本发明可以避免去除选择性标志和重组酶基因所需的ES细胞的操纵或任何额外的育种步骤。在多种实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。
[0011]提供了产生不含选择性标志基因和重组酶基因的非人类动物的经过遗传修饰的和克隆的多能干细胞的方法，其包括:(a)将核酸构筑体引入非人类动物的分化的体细胞中以产生经过遗传修饰的基因组；以及(b)将(a)的经过遗传修饰的基因组转移至多能干细胞中以产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的多能干细胞，其中这种核酸构筑体包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能ES细胞中而不在分化的体细胞中转录。在多种实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。
[0012]通过将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至多能干细胞或重编程为多能的任何体细胞(其中ES细胞特异性转录因子有活性)中，可以从多能干细胞的基因组中去除侧接有重组位点的选择性标志和重组酶基因。
[0013]在一个方面，提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，其中这种可自切除的重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有第一和第二重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志基因和重组酶基因可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中转录。
[0014]在一个实施方案中，分化的体细胞选自由以下组成的群组:皮肤细胞、血细胞、神经细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞以及脂肪细胞。
[0015]在一个实施方案中，分化的体细胞是成纤维细胞。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于选自由以下组成的群组的非人类动物:小鼠、大鼠、兔、禽类、母牛、猪、绵羊、山羊、马以及驴。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于猪。在一个更特定的实施方案中，猪是小型猪。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于母牛。
[0016]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子选自由以下组成的群组:Oct-3/4启动子、Sox2启动子、Kif4启动子、c-Myc启动子、Nanog启动子、Lin28启动子以及其组合。
[0017]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在囊胚期胚胎的ES细胞中转录。
[0018]在一个实施方案中，核酸构筑体包含介于第一和第二重组位点之间的第二表达盒，其中第二表达盒包含可操作地连接至启动子的选择性标志基因。在一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶基因的上游。在另一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶基因的下游。
[0019]在一个实施方案中，可操作地连接至选择性标志基因的启动子是组成性启动子。在一个实施方案中，组成性启动子选自由以下组成的群组.-Ubc启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、EF-1启动子、Pgkl启动子、β-肌动蛋白启动子以及R0SA26启动子。
[0020]在一个实施方案中，选择性标志选自由以下组成的群组:新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、嘌呤霉素N乙酰转移酶(pure/)、灭瘟素S脱氨酶(blasticidin S deaminase) (bsr1")、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱瘆病毒胸苷激酶(HSV-k)。
[0021]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达构筑体不包含选择性标志基因，并且选择性标志基因位于分化的体细胞的基因组中的另一个基因座(例如，呈反式)中，其中这种选择性标志基因上游和下游侧接有第三和第四重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，分化的体细胞在基因组中包含条件性敲除等位基因，其中这种条件性敲除等位基因上游和下游侧接有第一和第二重组位点以使得条件性等位基因可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，条件性敲除等位基因进一步包含介于第一和第二重组位点之间的选择性标志基因。
[0022]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个外显子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列侧接有第一和第二重组位点。在一个更特定的实施方案中，外显子是内源基因的第一外显子。
[0023]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个内含子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列侧接有第一和第二重组位点。
[0024]在一个实施方案中，核酸构筑体包含在内源基因的起始密码子上游的5’ -非翻译区(UTR)和在内源基因的终止密码子下游的3’-非翻译区(UTR)以使得整个内源基因可以经由同源重组被核酸构筑体置换。
[0025]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，经过修饰的序列是内源基因的至少一个外显子的敲入等位基因。在一个实施方案中，经过修饰的序列是整个内源基因的敲入等位基因(即，“基因交换敲入”)。敲入等位基因可以是向含有这种等位基因的动物赋予所需特征的等位基因，这些特征如改善的抗病性或更大的尺寸(例如，更大的肌肉尺寸)。在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含转基因序列，其中这种转基因序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，转基因序列编码人类蛋白质(例如，胰岛素、α-乳白蛋白、转铁蛋白、人血清白蛋白、人生长激素、凝血因子，等等)。在一个实施方案中，转基因序列编码治疗剂(例如，治疗性抗体)。
[0026]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列是内源基因的敲除等位基因。在一个实施方案中，敲除等位基因包含报告基因，其中报告基因的5’包含在内源基因的起始密码子(ATG)上游紧邻的核苷酸序列(即，5’非翻译区(5’-UTR))以使得报告基因的转录可以用驱使内源基因表达的内源启动子来起始，并且可以消除内源基因的转录。
[0027]在一个实施方案中，报告基因位于第一重组位点的上游。
[0028]在一个实施方案中，报告基因编码选自由以下组成的群组的报告蛋白:碱性磷酸酶、荧光素酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed以及ZsGreen。
[0029]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达盒位于分化的体细胞的基因组中的转录活性基因座中。在一个实施方案中，转录活性基因座是ROSA26基因座。在一个实施方案中，转录活性基因座是CH25h基因座。
[0030]在一个实施方案中，位点特异性重组酶选自由以下组成的群组:Cre、Flp以及Dre
重组酶。
[0031]在一个实施方案中，位点特异性重组酶是Cre重组酶。
[0032]在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列。在一个实施方案中，Cre重组酶包含核定位信号(NLS)。在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列与核定位信号(NLS)。
[0033]在一个实施方案中，第一和第二重组位点选自由以下组成