的群组:1οχΡ、10x511、1οχ2272、1οχ66、1οχ71、1οχΜ2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT 以及 Dre 位点。
[0034]在一个方面，提供了一种产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的方法，这种方法包括:
[0035](a)将核酸构筑体引入非人类动物的分化的体细胞中以产生经过遗传修饰的基因组；
[0036](b)将(a)的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中；
[0037](c)融合并活化(b)的卵母细胞以形成人工受精卵；
[0038](d)培养(C)的人工受精卵直至受精卵到达囊胚胚胎期；以及
[0039](e)将(d)的囊胚植入代孕母体的子宫中以形成不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物，
[0040]其中这种核酸构筑体包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中重组酶表达构筑体上游和下游侧接有第一和第二重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中转录。将分化的体细胞的经过修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中并且使人工产生的受精卵发育成克隆胚胎(其中ES细胞特异性转录因子在多能干细胞中有活性)之后，选择性标志和重组酶基因就从克隆胚胎的基因组中去除。
[0041]在一个实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。
[0042]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子选自由以下组成的群组:Oct-3/4启动子、Sox2启动子、Kif4启动子、c-Myc启动子、Nanog启动子、Lin28启动子以及其组合。
[0043]在多种实施方案中，可自切除的重组酶表达盒包含位于第一和第二重组位点之间的第二表达盒，其中第二表达盒包含可操作地连接至启动子的选择性标志基因。在一个实施方案中，选择性标志位于位点特异性重组酶基因的上游。在另一个实施方案中，选择性标志位于位点特异性重组酶基因的下游。
[0044]在一个实施方案中，可操作地连接至选择性标志基因的启动子是组成性启动子。在一个实施方案中，组成性启动子选自由以下组成的群组.-Ubc启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、EF-1启动子、Pgkl启动子、β-肌动蛋白启动子以及R0SA26启动子。
[0045]在一个实施方案中，选择性标志选自由以下组成的群组:新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、嘌呤霉素N乙酰转移酶(pure/)、灭瘟素S脱氨酶(bsf)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱瘆病毒胸苷激酶(HSV-k)。
[0046]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达构筑体不包含选择性标志基因，并且选择性标志基因位于分化的体细胞的基因组中的另一个基因座(例如，呈反式)中，其中这种选择性标志基因上游和下游侧接有第三和第四重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，分化的体细胞在基因组中包含条件性敲除等位基因，其中这种条件性敲除等位基因上游和下游侧接有第一和第二重组位点以使得条件性等位基因可以在位点特异性重组酶存在下从基因组中被去除。在一个实施方案中，条件性敲除等位基因包含介于第一和第二重组位点之间的选择性标志基因。
[0047]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个外显子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列侧接有第一和第二重组位点。在一个实施方案中，外显子是内源基因的第一外显子。
[0048]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个内含子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列上游和下游侧接有第一和第二重组位点。
[0049]在一个实施方案中，核酸构筑体是革El向构筑体，并且革El向构筑体的革El向臂包含在内源基因的起始密码子上游的5’-非翻译区(UTR)和在内源基因的终止密码子下游的3’-非翻译区(UTR)以使得整个内源基因可以经由同源重组被靶向构筑体置换。在一个实施方案中，靶向臂包含在内源基因的起始密码子上游紧邻的5’-UTR区。在一个实施方案中，靶向臂包含在内源基因的终止密码子下游紧邻的3’非翻译区。
[0050]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，经过修饰的序列是至少一个外显子的敲入等位基因。在一个实施方案中，经过修饰的序列是整个基因的敲入等位基因(即，“基因交换敲入”)。敲入等位基因可以是向含有这种等位基因的动物赋予所需特征的等位基因，这些特征如改善的抗病性或更大的尺寸(例如，更大的肌肉尺寸)。在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含转基因序列，其中这种转基因序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，转基因序列编码人类蛋白质(例如，胰岛素、α-乳白蛋白、转铁蛋白、人血清白蛋白、人生长激素、凝血因子，等等)。在一个实施方案中，转基因序列编码治疗剂(例如，治疗性抗体)。
[0051]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列是内源基因的敲除等位基因。在一个实施方案中，敲除等位基因包含报告基因，其中报告基因的5’包含在内源基因的起始密码子(ATG)上游紧邻的核苷酸序列(即，5’-非翻译区(5’ -UTR))以使得报告基因的转录用驱动内源基因的内源启动子来起始，并且消除内源基因的转录。
[0052]在一个实施方案中，报告基因位于第一重组位点的上游。在一个实施方案中，报告基因编码选自由以下组成的群组的报告蛋白:绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、ZsGreen以及lacZ。
[0053]在一个实施方案中，经由体细胞核转移技术(SCNT)将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中。
[0054]在一个实施方案中，将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组显微注射至无核的宿主卵母细胞的卵周隙(即，透明带与细胞膜之间的空隙)中。
[0055]在一个实施方案中，表达构筑体包含可操作地连接至启动子的选择性标志基因。在一个实施方案中，启动子是组成性启动子。在一个实施方案中，组成活性启动子选自由以下组成的群组:Ubc启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、EF-1启动子、Pgkl启动子、β -肌动蛋白启动子以及ROSA26启动子。
[0056]在一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶基因的上游。在一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶的下游。
[0057]在一个实施方案中，选择性标志是选自由以下组成的群组的抗药基因:新霉素磷酸转移酶(nec/)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、嘌呤霉素N乙酰转移酶(puix/)、灭瘟素S脱氨酶(bsf)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱瘆病毒胸苷激酶(HSV-k)。
[0058]在一个实施方案中，位点特异性重组酶选自由以下组成的群组:Cre、Flp以及Dre
重组酶。
[0059]在一个实施方案中，位点特异性重组酶是Cre重组酶。
[0060]在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列。在一个实施方案中，Cre重组酶包含核定位信号(NLS)。在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列与核定位信号(NLS)。
[0061]在一个实施方案中，第一和第二重组位点选自由以下组成的群组:1οχΡ、10x511、1οχ2272、1οχ66、1οχ71、1οχΜ2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT 以及 Dre 位点。
[0062]在一个方面，提供了一种获得经过遗传修饰的母牛或猪的方法，其包括以下步骤:遗传修饰猪或母牛的体细胞以包括自切除盒，这种自切除盒包含由在多能细胞中有活性的启动子驱动的重组酶基因，和侧接有重组酶位点以形成经过遗传修饰的猪或母牛基因组的选择基因；以及将经过遗传修饰的基因组引入适合的卵母细胞中，将卵母细胞培养至囊胚期，在适合的代孕母体中孕育囊胚，以及使囊胚发育成经过遗传修饰的子代。
[0063]在一个方面，提供了非人类动物的克隆的卵母细胞，其包含来自分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组，其中这种经过遗传修饰的基因组包含含有可自切除的重组酶表达盒的核酸构筑体，在这种重组酶表达盒中位点特异性重组酶基因可操作地连接至ES细胞特异性启动子，其中重组酶表达盒侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除。
[0064]在一个实施方案中，非人类动物选自由以下组成的群组:小鼠、大鼠、兔、禽类、母牛、猪、绵羊、山羊、马以及驴。
[0065]在一个实施方案中，分化的体细胞选自由以下组成的群组:皮肤细胞、血细胞、神经细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞以及脂肪细胞。
[0066]在一个实施方案中，分化的体细胞是成纤维细胞。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于选自由以下组成的群组的非人类动物:小鼠、大鼠、兔、禽类、母牛、猪、绵羊、山羊、马以及驴。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于猪。在一个更特定的实施方案中，猪是小型猪。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于母牛。
[0067]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子选自由以下组成的群组:0ct-3/4启动子、Sox2启动子、Kif4启动子、c-Myc启动子、Nanog启动子、Lin28启动子以及其组合。
[0068]在一个实施方案中，核酸构筑体包含介于第一和第二重组位点之间的第二表达盒，其中第二表达盒包含可操作地连接至启动子的选择性标志基因。在一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶基因的上游。在另一个实施方案中，选择性标志基因位于位点特异性重组酶基因的下游。
[0069]在一个实施方案中，可操作地连接至选择性标志基因的启动子是组成性启动子。在一个实施方案中，组成性启动子选自由以下组成的群组.-Ubc启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、EF-1启动子、Pgkl启动子、β-肌动蛋白启动子以及R0SA26启动子。
[0070]在一个实施方案中，选择性标志选自由以下组成的群组:新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、嘌呤霉素N乙酰转移酶(pure/)、灭瘟素S脱氨酶(bsf)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱瘆病毒胸苷激酶(HSV-k)。
[0071]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达构筑体不包含选择性标志基因，并且选择性标志基因位于分化的体细胞的基因组中的另一个基因座(例如，呈反式)中，其中这种选择性标志基因上游和下游侧接有第三和第四重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志基因可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，分化的体细胞在基因组中包含条件性敲除等位基因，其中这种条件性敲除等位基因上游和下游侧接有第一和第二重组位点以使得条件性等位基因可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，条件性敲除等位基因进一步包含介于第一和第二重组位点之间的选择性标志基因。
[0072]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个外显子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列上游和下游侧接有第一和第二重组位点。在一个更特定的实施方案中，外显子是内源基因的第一外显子。
[0073]在一个实施方案中，核酸构筑体包含与被靶向的内源基因的至少一个内含子同源的核苷酸序列，其中这种核苷酸序列上游和下游侧接有第一和第二重组位点。
[0074]在一个实施方案中，核酸构筑体包含在内源基因的起始密码子上游的5’ -非翻译区(UTR)和在内源基因的终止密码子下游的3’-非翻译区(UTR)以使得整个内源基因可以经由同源重组被核酸构筑体置换。
[0075]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，经过修饰的序列是内源基因的至少一个外显子的敲入等位基因。在一个实施方案中，经过修饰的序列是整个内源基因的敲入等位基因(即，“基因交换敲入”)。敲入等位基因可以是向含有这种等位基因的动物赋予所需特征的等位基因，这些特征如改善的抗病性或更大的尺寸(例如，更大的肌肉尺寸)。在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含转基因