序列，其中这种转基因序列位于侧接有第一和第二重组位点的区域外部。在一个实施方案中，转基因序列编码人类蛋白质(例如，胰岛素、α-乳白蛋白、转铁蛋白、人血清白蛋白、人生长激素、凝血因子，等等)。在一个实施方案中，转基因序列编码治疗剂(例如，治疗性抗体)。
[0076]在一个实施方案中，核酸构筑体进一步包含被靶向的内源基因的经过修饰的序列，其中这种经过修饰的序列是内源基因的敲除等位基因。在一个实施方案中，敲除等位基因包含报告基因，其中报告基因的5’包含在内源基因的起始密码子(ATG)上游紧邻的核苷酸序列(即，5’非翻译区(5’-UTR))以使得报告基因的转录可以用驱使内源基因表达的内源启动子来起始，并且可以消除内源基因的转录。
[0077]在一个实施方案中，报告基因位于第一重组位点的上游。
[0078]在一个实施方案中，报告基因编码选自由以下组成的群组的报告蛋白:碱性磷酸酶、荧光素酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed以及ZsGreen。
[0079]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达盒位于分化的体细胞的基因组中的转录活性基因座中。在一个实施方案中，转录活性基因座是ROSA26基因座。在一个实施方案中，转录活性基因座是CH25h基因座。
[0080]在一个实施方案中，位点特异性重组酶选自由以下组成的群组:Cre、Flp以及Dre重组酶。
[0081]在一个实施方案中，位点特异性重组酶是Cre重组酶。
[0082]在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列。在一个实施方案中，Cre重组酶包含核定位信号(NLS)。在一个实施方案中，Cre重组酶包含内含子序列与核定位信号(NLS)。
[0083]在一个实施方案中，第一和第二重组位点选自由以下组成的群组:1οχΡ、10x511、1οχ2272、1οχ66、1οχ71、1οχΜ2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT 以及 Dre 位点。
[0084]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子在克隆的卵母细胞中没有活性。在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子偶合至配体诱导性启动子，例如四环素(tet)开/关系统，以使得ES细胞特异性启动子的活性在不存在配体的情况下关闭，而启动子活性在施用适合的配体(例如，四环素)之后并且在ES细胞特异性转录因子存在下开启。
[0085]在一个方面，提供了一种在缺乏选择基因的H)代中制备经过遗传修饰的猪或母牛的方法，其包括遗传修饰猪或母牛的体细胞以包括自切除盒，这种自切除盒包含由在多能细胞中有活性的启动子驱动的位点特异性重组酶基因，和侧接有重组酶位点以形成经过遗传修饰的猪或母牛基因组的选择基因；以及将经过遗传修饰的基因组引入适合的卵母细胞中，将卵母细胞培养至囊胚期，在适合的代孕母体中孕育囊胚，以及使囊胚发育成经过遗传修饰的子代。
[0086]在一个方面，提供了一种修饰母牛或猪的分化的体细胞的基因组的方法，其包括:(a)向母牛或猪的分化的体细胞中引入包含以下的组合物:(i)第一核酸构筑体，其包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒含有可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因；以及(ii)第二核酸构筑体，其包含编码ES细胞特异性转录因子的基因，
[0087]其中这种重组酶表达盒侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且
[0088]其中这种ES细胞特异性转录因子能够活化ES细胞特异性启动子。
[0089]在一个实施方案中，ES细胞特异性转录因子是选自由以下组成的群组的至少一者:0ct-3/4、Sox2、c-Myc、Kif4、Nanog以及Lin28。在一个实施方案中，至少一个ES细胞特异性转录因子能够将分化的体细胞重编程为多能干细胞。
[0090]在一个实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。
【附图说明】
[0091]图1图解了用于产生经过遗传工程改造的和克隆的非人类动物的步骤。
[0092]图2图解了用于产生不含标志的、经过遗传修饰的非人类动物的可自切除盒。
[0093]图3图解了用于产生不含选择性标志的经过遗传工程改造的和克隆的非人类动物的步骤。
[0094]图4图解了用于产生经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的平台。
【具体实施方式】
[0095]术语表
[0096]如本文所用的术语“克隆”包括产生原始生物体的相同拷贝的过程。
[0097]如本文所用的术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”包括来源于胚胎的未分化的内团细胞的干细胞，其在引入胚胎中后可以有助于发育中的胚胎的任何组织。
[0098]如本文所用的短语“可操作地连接”包括将编码启动子的核苷酸序列连接至编码蛋白质的另一核苷酸序列以使得这个启动子控制编码蛋白质的核苷酸序列的表达。
[0099]如本文所用的术语“启动子”和“启动子调控元件”等等包括在核酸片段或基因内控制那个基因的表达的核苷酸序列元件。这些元件还可以包括表达控制序列。来自多种来源的启动子调控元件等等可以有效地用于促进基因表达。启动子调控元件有意包括组成性、组织特异性、发育特异性、诱导性、亚基因组启动子，等等。启动子调控元件还可以包括改善或调控转录效率的某些增强子元件或沉默元件。
[0100]如本文所用的术语“组成性启动子”和“组成活性启动子”包括在大多数时间内引导基因在大多数细胞或组织中转录的调控序列。
[0101 ] 如本文所用的术语“多能干细胞”或“多潜能干细胞”包括具有发育成一种以上分化的细胞类型的能力的未分化细胞。
[0102]如本文所用的术语“重组位点”包括由位点特异性重组酶识别并且可以充当重组事件的底物的核苷酸序列。
[0103]如本文所用的术语“位点特异性重组酶”包括一组可以促进“重组位点”之间重组的酶，其中两个重组位点在单个核酸分子内实体分离或在独立的核酸分子上。“位点特异性重组酶”的实例包括(但不限于)Cre、Flp以及Dre重组酶。
[0104]如本文所用的术语“体细胞”包括构成生物体的身体的具有两组染色体(2n)的任何细胞，而排除具有单组染色体(η)的生殖细胞。
[0105]如本文所用的术语“体细胞核转移”或“SCNT”包括将来自供体动物(如绵羊、牛、猪、山羊、兔、大鼠或小鼠)的体(身体)细胞的细胞核转移至无核卵子(已经去除了自身的细胞核的卵子)的细胞质中的技术。可以通过本发明方法对细胞核进行遗传修饰。处于卵子内部之后，用卵子细胞质因子将体细胞核重编程以成为受精卵(受精卵子)的细胞核。受精卵子然后可以在试管内发育至例如囊胚期，随后将其转移至受体动物，通常是与供体相同的物种，从而产生含有以克隆方式来源于受精卵子并且具有被引入转移的细胞核中的任何遗传修饰的细胞的后代。可以使用许多体细胞类型，包括乳腺上皮细胞、卵巢卵丘细胞、来自皮肤和内脏器官的成纤维细胞、各种内脏器官细胞、塞尔托利细胞(Sertoli cell)、巨噬细胞以及血液白细胞(参看例如Tian等，生殖生物学与内分泌学l(ReproductiveB1logy and Endocrinologyl)， 1-7(2003))。
[0106]包含可自切除的重组酶表达盒的体细胞
[0107]已经作出许多努力以在遗传修饰之后从宿主细胞或宿主动物中去除选择性标志和重组酶基因。举例来说，为了去除侧接有重组位点(例如，1xP或FRT)的选择性标志基因，经由例如显微注射、转染或用病毒粒子转导将位点特异性重组酶基因引入ES细胞或受精卵子中。或者，将携带选择盒的动物育种为表达位点特异性重组酶的缺失品系以达到相同的效果。然而，这些技术具有许多缺点，包括在ES细胞中低水平的转染效率；由于延长的试管内培养所致的ES细胞多能性下降；以及需要附加的人力和财政资源用于额外的育种步骤。
[0108]本发明提供了一种新的方法以在遗传修饰之后从非人类动物中去除选择性标志和重组酶基因，这是通过向分化的体细胞中引入由ES细胞特异性启动子驱动的可自切除的位点特异性重组酶基因，接下来经由例如体细胞核转移(SCNT)技术将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中来完成。在融合和活化后，在试管内培养包含体细胞的经过遗传修饰的基因组的人工产生的受精卵直至其到达囊胚期并且将其植入代孕母体中以供完全发育(参看例如Gong等，从不同类型的体细胞产生克隆小牛(Generat1n of cloned calves from different types of somatic cells),Sci ChinaC Life Sci，2004，47:470-476 ;以全文引用的方式并入本文中)。在人工产生的受精卵发育期间，位点特异性重组酶在ES细胞特异性转录因子有活性的多能干细胞中被表达并且有活性，并且选择性标志和重组酶基因从克隆胚胎的基因组中缺失。以这种方式，这种方法避免了对去除选择性标志和重组酶基因所需的ES细胞的操纵或任何额外的育种步骤的需要。
[0109]提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过遗传工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中，例如在囊胚期胚胎的内细胞团中的ES细胞中表达，而不在分化的体细胞中表达。
[0110]在一个方面，提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，其中这种可自切除的重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种位点特异性重组酶基因上游和下游侧接有第一和第二重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在体细胞中转录。
[0111]将分化的体细胞的经过修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中之后，以及使人工产生的受精卵发育成胚胎之后，可以从发育中的克隆胚胎的基因组中去除选择性标志和重组酶基因。
[0112]在一个实施方案中，分化的体细胞包括(但不限于)皮肤细胞、血细胞、神经细胞、肌细胞、骨细胞、肾细胞、肝细胞以及脂肪细胞。
[0113]在一个实施方案中，分化的体细胞是成纤维细胞。成纤维细胞可以来源于任何非人类动物，包括(但不限于)小鼠、大鼠、兔、禽类、母牛、猪、绵羊、山羊、马以及驴。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于猪。在一个更特定的实施方案中，猪是小型猪。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于母牛。
[0114]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子选自由以下组成的群组:0ct-3/4启动子、Sox2启动子、Kif4启动子、c-Myc启动子、Nanog启动子、Lin28启动子以及其组合。
[0115]在一个实施方案中，ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在囊胚期胚胎的ES细胞中转录。
[0116]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达盒包含介于第一和第二重组位点之间的第二表达盒，其中第二表达盒包含可操作地连接至启动子的选择性标志基因。在一个实施方案中，选择性标志位于位点特异性重组酶基因的上游。在另一个实施方案中，选择性标志位于位点特异性重组酶基因的下游。
[0117]在一个实施方案中，可操作地连接至选择性标志基因的启动子是组成性启动子。在一个实施方案中，组成性启动子选自由以下组成的群组.-Ubc启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、EF-1启动子、Pgkl启动子、β-肌动蛋白启动子以及ROSA26启动子。
[0118]在一个实施方案中，选择性标志选自由以下组成的群组:新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hyf)、嘌呤霉素N乙酰转移酶(pure/)、灭瘟素S脱氨酶(bsf)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)以及单纯疱瘆病毒胸苷激酶(HSV-k)。
[0119]在一个实施方案中，可自切除的重组酶表达构筑体不包含选择性标志基因，并且选择性标志基因位于体细胞的基因组中的另一个基因座(例如，呈反式)中，其中这种选择性标志基因上游和下游侧接有第三和第四重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志可以在位点特异性重组酶存在下被去除。
[0120]在一个实施方案中，分化的体细胞在基因组中包含条件性敲除等位基因，其中这种条件性敲除等位基因上游和下游侧接有第一和第二重组位点以使得条件性等位基因可以在位点特异性重组酶存在下被去除。在一个实施方案中，条件性敲除等位基因包含介于第一和第二