一种肺癌的筛查试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及一种肺癌的筛查试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。 近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均 占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。非小细胞型肺癌是肺癌 中的一类，其约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。因 此，对肺癌进行早期、快速诊断非常重要。目前，肺癌的诊断大都依赖于活体检测肺部组织， 但是此种检测方法的操作复杂，对患者的肺损伤极大，而且有可能导致肺癌扩散，存在极大 的风险。寻找更为简便、创伤小、副作用小的检测方法亟待解决。
[0003] E-巧黏蛋白化-Cadeherin)，是巧依赖性黏附蛋白家族中的重要成员之一，介导同 型细胞间的粘附反应，是维持细胞间正常结构的基础，与浸润转移有关，它在上皮恶性肿瘤 中最重要的生理功能是抑制肿瘤细胞脱落后发生转移，其表达的缺失或者减低可能与人癌 细胞的去分化、侵袭性和转移性倾向有关。
[0004] 目前，关于E-巧黏蛋白与肺癌的关系的研究均着眼于E-巧黏蛋白在肺癌组织或者 肺组织中的表达状况。如，周黯等，"Livin、CD44V6、E-巧黏蛋白在非小细胞肺癌组织中的表 达及意义"，苏州大学，内科学，2008，硕±的研究发现，E-巧黏蛋白在肺癌患者的肺癌组织 中则阳性表达下调，明显低于肺癌患者的癌旁组织与健康人肺组织，而肺癌患者的癌旁组 织与健康人肺组织中E-巧黏蛋白的阳性表达均较高，且二者的水平相当，没有明显差异。
[0005] 因此，根据现有文献的报道，只能通过检测肺癌可疑组织中的E-巧黏蛋白是否未 表达来筛查肺癌，同样存在创伤大、副作用大、操作不简便的问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种创伤小、副作用小、便于使用的肺癌检测试 剂盒。
[0007] 本发明肺癌的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测血液中E-巧黏蛋白表达水平的 试剂。
[0008] 其中，所述检测血液中E-巧黏蛋白表达水平的试剂是化ISA检测用试剂。
[0009] 其中，所述检测血液中E-巧黏蛋白表达水平的试剂是Western-blot检测方法用试 剂。
[0010] 本发明还提供了检测血液中E-巧黏蛋白表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂 中的用途。
[0011]其中，所述检现恤液中E-巧黏蛋白表达水平的试剂是化ISA检测用试剂。
[0012] 其中，所述检测血液中E-巧黏蛋白表达水平的试剂是Western-blot检测方法用试 剂。
[0013] 通常认为，E-巧黏蛋白只在癌症组织中的表达水平有变化，但是本发明人却发现 其在血液中的表达水平也有非常显著的变化，而且在血液中的变化趋势与其在组织中的变 化趋势W及现有的研究相反:现有技术的研究认为，E-巧黏蛋白在肿瘤组织中的丢失导致 肿瘤细胞的恶化，而且E-巧黏蛋白在肺癌组织中的阳性表达显著低于癌旁肺组织W及健康 人肺组织，E-巧黏蛋白在组织中的表达与肺癌成负相关;但是，本发明人却发现，E-巧黏蛋 白在肺癌患者血液中的表达水平大大高于健康人血液，E-巧黏蛋白化-Cadeher in)在血液 中的表达水平与肺癌成正相关，因而可W同感筛查待检人群血液中E-巧黏蛋白（E- 化deherin)的表达水平达到筛查其患肺癌可能性的目的。
[0014] 本发明试剂盒通过检测E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表达水平，可W判断待检人 群患肺癌的风险:若E-巧黏蛋白化-Cadeher iη)的表达水平高，则患肺癌的风险高，若E-巧 黏蛋白化-Cadeherin)的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺癌的辅助诊断，本 发明试剂盒仅仅只需采集待检样本的血液，就可W筛查其患肺癌的风险，创伤小、副作用 小、使用方便，临床应用前景良好。
[0015] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0016] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0017]图1肺癌患者/健康对照血浆检测结果
[0018] 图2 E-化化erin敏感度及特异性分析
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 E-巧黏蛋白化-化deherin)的表达水平与肺癌的关系
[0020] 一、实验方法
[0021] 1、样本
[0022] 临床资料
[0023] 选取肺癌患者139例，健康对照58例，其临床资料如下：
[0024]
[0025] ~*注:其他包括大细胞癌、腺鱗癌、小细胞癌。
[0026] 2、血液中E-巧黏蛋白化-化deherin)表达水平的检测方法
[0027] 2.1血液分离
[002引抽取临床患者及健康对照血液，EDTA抗凝后离屯、（12(K)rpm，lOmin)，将上清吸取后 进行第二次离屯、（300化pm，15min)，吸取上清分装后-80度保存；
[0029] 2.沈 LISA 检测
[0030] 采用R&D公司检测试剂盒(DY648)W及DuoSet Ancillary Reagent kit 2，DY008。
[0031] 检测步骤：
[0032] (1)将捕获抗体(Cap化re ant化ody)用PBS稀释至工作浓度后按10化1/孔加到96 孔板，室溫解育过夜；
[0033] (2)弃上清，用40化1洗涂液(Wash buffer)洗Ξ次，并在吸水纸上拍打W完全去除 液体；
[0034] (3)加入300μ1试剂稀释液(reagent diluent),室溫上封闭1小时；
[0035] (4)重复步骤(2);
[0036] (5)加入10化1 E巧蛋白标准品化-ca化erin standard)及检测样品，W试剂稀释 液(reagent diluent)为空白对照，室溫解育2小时；
[0037] (6)重复步骤(2);
[0038] (7)加入100μΙ检测抗体(Detection antibody),室溫解育2小时；
[0039] (8)重复步骤(2);
[0040] (9)加入10化1酶联免疫亲和素（Strep化vidin-HRP)，避光后解育20分钟；
[0041 ] (10)重复步骤(2);
[0042] (11)加入100μΙ显色的底物溶液(Substrate solution),避光后解育20分钟；
[0043] (12)加入50μ1终止液（Stop solution)，在酶标仪上用45化m波长读板，根据标准 品浓度及吸光值，自动算出各样品浓度。
[0044] 2.3结果统计
[0045] 样本浓度:酶标仪根据标准品浓度及吸光值，自动算出各样品浓度；
[0046] 差异性分析:采用SPSS17.0对实验组(肺癌患者)和对照组(健康体检人群)进行统 计分析，用Gra地Pad Prism 5.0软件绘制图片。
[0047] 3、血浆中E-巧黏蛋白化-化deherin)的表达水平与肺癌的相关性 [004引检测结果如下表1和图1~2:
[0049] 表1血浆中E-巧黏蛋白化-化deherin)与肺癌的相关性
[(K)加]
[0051] 经过统计学分析，二者的差异显著(p<0.001，AN0VA)。
[0052] 由表1和图1可W看出，与健康人群相比，肺癌患者的血液中E-化化erin表达水平 明显升高，且差异极显著(p<0.0001);
[0053] 由图2可W看出，E-Ca化erin最佳cut-off值为〉881化g/ml，AUC为97.8%，与健康 对照组相比，E-化化erin的诊断特异性为96.6%，敏感度为91.4%。
[0054]由W上结果可W看出，与健康人群相比，肺癌患者的E-巧黏蛋白巧-Cadeherin)表 达水平显著升高(P<〇.〇〇l)，说明肺癌与血液中E-巧黏蛋白巧-化deherin)的表达水平呈正 相关，血液中E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的高表达会显著提高患肺癌的可能性。因此，可W 通过检测待检人群血液中E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表达水平，将肺癌的易感人群筛查 出来。
[0055]实施例2本发明检测血液E-巧黏蛋白巧-Cadeherin)的试剂盒的组成及其使用方 法
[0056] -、ELISA检测试剂盒
[0化7] 1、试剂盒的组成
[005引检测试剂盒(50人份）：
[0化9]
[0060] 2、试剂盒的使用方法
[0061 ] 抽取待检样本血液，EDTA抗凝后离屯、（120化pm，lOmin)，将上清吸取后进行第二次 离屯、（3000rpm，15min)，吸取上清，采用如下方法检测E-巧黏蛋白化-Cadeherin)的表达水 平：
[0062] (1)将捕获抗体(Cap化re ant化ody)用PBS稀释至工作浓度后按10化1/孔加到96 孔板，室溫解育过夜；
[0063] (2)弃上清，用40化1洗涂液(Wash buffer)洗Ξ次，并在吸水纸上拍打W完全去除 液体；
[0064] (3)加入300μ1试剂稀释液(reagent diluent),室溫上封闭1小时；
[0065] (4)重复步骤(2);
[0066] (5)加入10化1 E巧蛋白标准品化-ca化erin standard)及检测样品，W试剂稀释 液(reagent diluent)为空白对照，室溫解育2小时；
[0067] (6)重复步骤(2);
[0068] (7)加入100μΙ检测抗体(Detection antibody),室溫解育2小时；
[0069] (8)重复步骤(2);
[0070] (9)加入10化1酶联免疫亲和素 （Strep化vidin-HRP)，避光后解育20分钟；
[0071] (10)重复步骤(2);
[0072] (11)加入100μΙ显色的底物溶液(Substrate solution),避光后解育20分钟；
[0073] (12)加入50μ1终止液（Stop solution)，在酶标仪上用45化m波长读板，根据标准 品浓度及吸光值，自动算出各样品浓度。
[0074] 综上，本发明试剂盒通过检测E-巧黏蛋白化-化deherin)的表达水平，可W筛查待 检人群患难肺癌的风险:若E-巧黏蛋白化-Cadeher in)的表达水平高，则患肺癌的风险高， 若mic;roRNA-153的表达水平低，则患肺癌的风险高，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采 取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
【主权项】
1. 一种肺癌的筛查试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测血液中E-钙黏蛋白表 达水平的试剂。2. 根据权利要求1所述的的筛查试剂盒，其特征在于:所述检测血液中E-钙黏蛋白表达 水平的试剂是ELISA检测用试剂。3. 根据权利要求1所述的的筛查试剂盒，其特征在于:所述检测血液中E-钙黏蛋白表达 水平的试剂是We s t ern-b 1 〇 t检测方法用试剂。4. 检测血液中E-钙黏蛋白表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于:所述检测血液中E-钙黏蛋白表达水平的试 剂是ELISA检测用试剂。6. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于:所述检测血液中E-钙黏蛋白表达水平的试 剂是We s t ern-b 1 〇 t检测方法用试剂。
【专利摘要】本发明公开了一种肺癌的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测血液中E-钙黏蛋白表达水平的试剂。本发明还公开了检测血液中E-钙黏蛋白表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。本发明试剂盒通过检测E-钙黏蛋白的表达水平，能有效判断待检人群患肺癌的风险，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105628920
【申请号】CN201511022765
【发明人】李为民, 张立, 刘伦旭, 刘丹, 王业, 唐怀蓉, 黄燕, 田攀文, 朱苡晗, 谭政堂, 王彦文
【申请人】四川大学华西医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月30日