一种torch筛查试剂卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡，可用于血清或血浆样本中TORCH十项，即弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯性疱疹1型和2型病毒(HSV-I/II)的IgG/IgM类的抗体检测。本实用新型试剂卡由上下两块塑料模板、缓冲液缓释模块和一条或多条试剂条组成，试剂条由背衬上依次紧密相连的吸水垫、硝酸纤维素膜、上样垫、标记物结合垫和样品垫组成。相邻各部分间有1-2mm的重叠，缓冲液缓释模块覆盖在样品垫上。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，捕获抗TORCH?IgG/IgM抗体。整个检测过程仅需10～15min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合计生站，社区医院等机构进行简单的TORCH筛查检测。
【专利说明】一种TORCH筛查试剂卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种检测病原微生物的试剂卡，具体涉及一种TORCH筛查的免疫层析快速检测试剂卡。
【背景技术】
[0002]TORCH指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它是一组病原微生物的英文名称缩写，其中T(Toxopasma)是弓形虫,R(Rubella.Virus)是风疫病毒，C(Cytomegal0.Virus)是巨细胞，H(Herpes.Virus)即是单纯疱疫 I / II 型。
[0003]TORCH感染是严重危害新生儿健康的重要因素之一。孕妇发生病毒血症时，病毒可通过胎盘或产道传播感染胎儿，引起早产、流产、死胎或畸胎等，以及引起新生儿多个系统、多个器官的损害，造成不同程度的智力障碍等症状。因此，TORCH感染的血清学筛查对优生优育具有重要现实意义，对孕妇开展TORCH感染的血清学筛以便及早发现不良妊娠并及时处理。对新生儿开展TORCH检测，了解新生儿TORCH感染情况，以便早干预、早治疗。
[0004]目前，在我国TORCH早期筛查方法最常用是采用ELISA酶免诊断技术。ELISA酶免检测方法是检测人体血清中的特异性IgM、IgG抗体，但ELISA试剂存在对设备、环境、操作技能等要求，需要较长的检测时间，不便于在小型计生站，社区医院等技术设备条件相对不足的基层卫生机构开展样本筛选。
[0005]相比前述几种方法，免疫层析快速检测技术将反应时间大大缩短，且操作简单，不需要配备复杂仪器设备，结果直观肉眼可判断。
[0006]优生优育关系民族未来，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂迫在眉睫。
【发明内容】
[0007]本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，抗干扰，简便快速，生产成本低的TORCH免疫层析快速检测试剂卡。
[0008]本实用新型提供的TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡，包括试剂条、缓冲液缓释模块和上下两块塑料模板。
[0009]所述试剂条包括背衬、附着在背衬上依次紧密相连的吸水垫、硝酸纤维素膜、上样垫、标记物结合垫和样品垫。背衬的两端，分别设有吸水垫和样品垫，背衬中部设有硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜与样品垫中间，设有上样垫和标记物结合垫，上样垫一端部分设置在硝酸纤维素膜之上，一端部分设置在标记物结合垫之下，标记物结合垫一端部分设置在上样垫之上，另一端部分设置在样品垫之下。
[0010]所述上样垫一端部分设置在硝酸纤维素膜之上，与硝酸纤维素膜设有l-2mm的重叠区；所述上样垫另一端部分设置在标记物结合垫之下，与标记物结合垫设有1_2_的重叠区；所述标记物结合垫设置在样品垫之下，与样品垫设有1_2_的重叠区，重叠区保证样品在样品垫、标记物结合垫、上样垫和硝酸纤维素膜上无阻碍地流动。[0011]所述试剂条可以是一条或者多条。
[0012]所述缓冲液缓释模块覆盖在样品垫之上，缓冲液缓释模块为吸水纤维。其作用为吸收加入纯化水，形成缓冲溶液，保持模块内较高的水分含量，并能缓慢并持续释放到试剂条上，通过样品垫洗脱免疫微球。
[0013]所述塑料模板用于固定缓冲液缓释模块与背衬，塑料模板上设置上样孔、缓冲液加入孔和结果观测窗，用于滴加样品、观测检测结果。
[0014]所述背衬为PVC板，也可以代之以不吸水的硬质材料，用于固定盒内各组建；所述
背衬可以是一条或者多条。
[0015]所述吸水垫由滤纸制成，用于将反应过程中多余的溶液吸收。
[0016]所述硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线T和质控线C，检测线上包被有TORCH重组抗原，质控线上包被有羊抗鼠IgG，所述检测线可以是一条、二条或二条。
[0017]所述上样垫为玻璃纤维，用于缓冲样品pH值，进行抗干扰处理。
[0018]所述标记物结合垫由聚酯膜制成，包被有免疫微球与标记微球的结合物，所述免疫微球可以是鼠抗人IgG抗体或鼠抗人IgM抗体中的一种，所述标记微球可以是荧光颗粒、乳胶颗粒或者磁性颗粒。
[0019]所述样品垫为玻璃纤维，用于调解缓冲溶液pH值，形成试剂条最佳反应环境，连接并阻隔缓冲液缓释模块与标记物结合垫。
[0020]本实用新型试剂卡具有如下有益效果:
[0021](I)操作简单快捷。本实用新型试剂卡将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检测时间，且样品无需特殊处理，2-3分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取结果。可同时检测一项或多项指标，简化了操作流程。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。
[0022](2)抗干扰。本实用新型试剂卡，通过产品特殊的结构，样品层析先于免疫微球层析，上样垫组份抑制样品中RF因子嗜异性抗体等干扰物的影响，通过多孔吸水材料模块持续缓慢释放缓冲溶液，胶体金标记物缓慢持续洗脱，并且在检测时间内完全释放，与检测线捕获的待测抗体结合，减小了其他非相关IgG / IgM对胶体金标记物产生的竞争性结合干扰。
[0023](3)检测项目自由组合。通过改变试剂条数量，每条试剂条中T线数量，T线包被原料种类(重组TORCH抗原X 5种)，标记微球种类(胶体金颗粒、乳胶颗粒等)免疫微球种类(标记微球标记抗人IgG单克隆抗体+标记微球标记抗人IgM单克隆抗体=2种)，可以自由组合出单块试剂卡检测任意TORCH筛查项目(共10项)。
[0024](4)成本低，易推广。本实用新型试剂卡生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡试剂条结构示意图，其中I为吸水垫，2为硝酸纤维素膜,3为上样垫,4为标记物结合垫,5为样品垫,6为背衬,7为质控线,8.1为检测线-1，8.2为检测线-2，8.3为检测线-3。
[0026]图2为TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡检测系统结构示意图，其中9为缓冲液释放模块，10.1为试剂条1，10.2为试剂条2，10.3为试剂条3。
[0027]图3为TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡正面结构示意图，其中11为塑料模板，12为结果观测窗，13为上样孔，14为缓冲液加入孔。
[0028]图4为TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡底面面透视结构示意图，其中9为缓冲液释放模块，10.1为试剂条1，11为塑料模板，12为结果观测窗，13为上样孔。
[0029]图5，图6，图7为TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡结果判定示意图，其中Cl、C2、C3为质控线，T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8为检测线。图5判读结果有效，其中T3、T4、T7为阴性结果，T1、T2、T5、T6、T8为阳性结果；图6，图7判读结果无效。
【具体实施方式】
[0030]本实用新型试剂卡设计通过增减检测线包被抗体，选择抗人IgG / IgM标记物，增减同一塑料模板内试剂条的种类，达到检测任意TORCH项目组合的目的。
[0031]以下以胶体金联合快速检测Toxo-1gG / IgM(弓形虫)，RV-1gG / IgM(风疫病毒)，CMV-1gG / IgM(巨细胞病毒)，HSV-1 / I1-1gM(单纯性疱疹I型和2型病毒)试剂卡为例，结合附图，详细描述本实用新型试剂的制备和使用方法。
[0032]如图1显示的本实用新型试剂盒的结构示意图:背衬6上依次紧密相连吸水垫1、硝酸纤维素膜2、上样垫3、标记物结合垫4和样品垫5。背衬6的两端，分别设有吸水垫I和样品垫5，背衬中部设有硝酸纤维素膜2。硝酸纤维素膜2与样品垫5中间，设有上样垫3和标记物结合垫4，上样垫3 —端部分设置在硝酸纤维素膜2之上，一端部分设置在标记物结合垫之下4，标记物结合垫4 一端部分设置在上样垫3之上，另一端部分设置在样品垫5之下。
[0033]如图2所示，缓冲液缓释模块覆盖在试剂条1、试剂条2、试剂条3的样品垫之上。
[0034]如图3所示，塑料模板11上设置上样孔13、缓冲液加入孔14和结果观测窗12，用于滴加样品、观测检测结果。
[0035]本实用新型试剂卡的制备包括胶体金溶液的制备，胶体金标记抗人IgG单克隆抗体的制备，胶体金标记抗人IgM单克隆抗体的制备，检测线和质控线的包被，金标垫的制备，试剂卡的组装。
[0036]1.胶体金溶液的制备
[0037](I)用5晕升微量移液器取3晕升I %四氯金酸于500晕升的圆底烧瓶中，量取297毫升的超纯水亦加入烧瓶中，配制成0.01%的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀；
[0038](2)连接上蛇形冷凝管，开启冷凝水，并置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸；
[0039](3)放入搅拌子，剧烈搅拌，然后一次性快速准确地加入3毫升柠檬酸钠溶液；
[0040](4)金黄色的氯金酸水溶液首先变成灰色，约2分钟后变成紫红色，继续煮沸5分钟；
[0041](5)关闭磁力加热搅拌器,待胶体金冷却后,分装于500毫升的玻璃试剂瓶中，夕卜面覆上铝箔，按规定贴上标签。
[0042]制备的胶体金应呈现透亮的紫红色，没有聚合物及肉眼可见的沉淀；取适量于530纳米波长处测定，紫外吸收值在1.1-1.3之间。
[0043]2.胶体金标记抗人IgG单克隆抗体的制备
[0044]取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0.lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗人IgG单抗，搅拌20min,再逐滴加入2mL25mol / L聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min,弃上清液，加入 IOmL pH7.4PBS 缓冲液(含0.4mol / L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解,用0.22um无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。
[0045]3.胶体金标记抗人IgM单克隆抗体的制备
[0046]取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0.1mol / L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗人IgM单抗，搅拌20min,再逐滴加入2mL25mol / L聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min,弃上清液，加入 IOmL pH7.4PBS 缓冲液(含0.4mol / L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解,用0.22um无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。
[0047]4.检测线和质控线包被
[0048](I)检测线划线:用点膜机把弓形虫重组抗原、风疹病毒重组抗原、巨细胞病毒重组抗原、单纯性疱疹I型重组抗原和单纯性疱疹2型重组抗原按Iul / cm的量喷在硝酸纤维素膜上，作为检测线。其中Tl为弓形虫重组抗原，T2为风疹病毒重组抗原，T3为巨细胞病毒重组抗原,T4为弓形虫重组抗原，T5为风疹病毒重组抗原，T6为巨细胞病毒重组抗原，T7为单纯性疱疹I型病毒重组抗原，T8为单纯性疱疹2型病毒重组抗原。
[0049](2)质控划线:羊抗鼠IgG抗体包被液装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按Iul / cm的量划上，作为质控线C1、C2、C3。
[0050](3)干燥:将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥8小时，密闭保存待用。
[0051]5.金标垫制备
[0052](I)用喷金机，将制备好的金标记抗人IgG单克隆抗体以2ul / cm的喷量包被在标记物结合垫上，37°C烘箱干燥8h。
[0053](2)用喷金机，将制备好的金标记抗人IgM单克隆抗体以2ul / cm的喷量包被在标记物结合垫上，37°C烘箱干燥8h。
[0054]6.试剂卡的组装。
[0055]在PVC背衬上按顺序粘上吸水垫、硝酸纤维素膜、上样垫、标记物结合垫、样品垫，组成3种试剂条。其中，试剂条I上的结合垫为金标记抗人IgG单克隆抗体，用于检测弓形虫，风疹病毒，巨细胞病毒IgG ;试剂条2上的结合垫为金标记抗人IgM单克隆抗体，检测弓形虫，风疹病毒，巨细胞病毒IgM ;试剂条3上的结合垫为金标记抗人IgM单克隆抗体，检测单纯性疱疹I型和2型病毒IgM。
[0056]用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，3种试剂条分别装入同一塑料模板(下)卡槽中，压上缓冲液缓释模块，压上塑料模板(上)制成检测试剂卡，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
[0057]6.TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡检测实施操作方法
[0058]6.1样品制备[0059]样品可以使用血清或者血浆。
[0060]6.2检测步骤
[0061]从包装袋中取出试剂卡，用滴管吸取待检样品(血清/血浆)，在各加样孔中滴入I滴(约30uL)，再用滴管/移液器吸取纯净水，在缓存液注入孔中加入ImL纯净水，加入纯净水后开始计时，结果可在10?15min读取,超过30min判读无效。
[0062]6.3结果判读
[0063]读取结果时，将试剂卡水平置于观察者正面读取。
[0064]针对本例试剂卡，检测项目为:
[0065]Tl:检测弓形虫IgG,
[0066]T2:检测风疹病毒IgG，
[0067]T3:检测巨细胞病毒IgG，
[0068]T4:检测弓形虫IgM，
[0069]T5:检测风疫病毒IgM,
[0070]T6:检测巨细胞病毒IgM，
[0071]T7:检测单纯性疱疹I型病毒IgM，
[0072]T8:检测单纯性疱疹2型病毒IgM。
[0073]检测结果的解释。
[0074]有效性:C1、C2、C3质控线位置有红色显色线表明，本次判读结果有效。
[0075]阴性(-):检测该项目的检测线位置无显色，表明样品中该项目抗体浓度低于其最低检测限或无该项目抗体。如图5所示，t3，t4，t7对应检测项目为阴性，即巨细胞病毒IgG、弓形虫IgM、单纯性疱疹I型病毒IgM阴性。
[0076]阳性(+):检测该项目的检测线位置有红色显色线，表明样品中该项目抗体浓度高于其最低检测限，检测线颜色越深，表明样品中该项目抗体浓度越高。如图5所示，tl，t2，t5，t6，t8对应检测项目为阳性，即弓形虫IgG、风疹病毒IgG、风疹病毒IgM、单纯性疱疹2型病毒IgM阳性。
[0077]无效:1条及以上质控线位置无显色，可能操作不当或试剂卡已失效。应再次阅读说明书，并用新试剂卡重新测试。如图6、图7所示。
【权利要求】
1.一种TORCH筛查免疫层析快速检测试剂卡，包括试剂条、缓冲液缓释模块和上下两块塑料模板，其特征在于:试剂条包括背衬、附着在背衬上依次紧密相连的吸水垫、硝酸纤维素膜、上样垫、标记物结合垫和样品垫；背衬的两端，分别设有吸水垫和样品垫，背衬中部设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜与样品垫中间，设有上样垫和标记物结合垫，上样垫一端部分设置在硝酸纤维素膜之上，一端部分设置在标记物结合垫之下，标记物结合垫一端部分设置在上样垫之上，另一端部分设置在样品垫之下。
2.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述上样垫一端部分设置在硝酸纤维素膜之上，与硝酸纤维素膜设有l_2mm的重叠区；所述上样垫另一端部分设置在标记物结合垫之下，与标记物结合垫设有1_2_的重叠区；所述标记物结合垫设置在样品垫之下，与样品垫设有l-2mm的重叠区。
3.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述试剂条可以是一条或者多条。
4.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述缓冲液缓释模块覆盖在样品垫之上，缓冲液缓释模块为吸水纤维。
5.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述塑料模板上设置上样孔、缓冲液加入孔和结果观测窗。
6.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线T和质控线C，检测线上包被有TORCH重组抗原，质控线上包被有羊抗鼠IgG,所述检测线可以是一条、二条或二条。
7.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述标记物结合垫由聚酯膜制成，包被有免疫微球与标记微球的结合物，所述免疫微球可以是鼠抗人IgG抗体或鼠抗人IgM抗体中的一种，所述标记微球可以是荧光颗粒、乳胶颗粒或者磁性颗粒。
8.如权利要求1所说的试剂卡，其特征在于所述上样垫为玻璃纤维。
【文档编号】G01N33/569GK203465268SQ201320490976
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】刘彬彦, 张开山 申请人:杭州华得森生物技术有限公司