专利名称：筛查结直肠癌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛查结直肠癌的试剂盒。
背景技术：
结直肠癌近年在全球发病率直线上升，近些年来每年超过百万人死于结直肠癌。 由于结直肠癌的发生与生活习惯，特别是饮食习惯密切相关，因此近年随着我国人民生活水平的逐渐提高，结直肠癌的发病率和致死率在我国飞速增长。研究表明，结直肠癌的早期诊断尤为关键，早期发现结直肠癌患者的五年存活率高达90%，而目前结直肠癌早期发现率不足40%，一旦转移，结直肠癌患者存活率不足10%。目前诊断结直肠癌的“金标准”是结肠镜，目前公认，年龄大于50岁的人均应该接受肠镜筛查。美国以及欧洲等权威部门指出，对于具有家族性高发病史或由于个人习惯患病风险高的人来说肠镜筛查尤为重要。但是，目前我国还不具备在体检中广泛进行肠镜检测的条件，受试者的痛苦也不言而喻。目前在我国体检中广泛推行结肠镜检测不现实。因此，筛选血浆中结直肠癌早期诊断分子标记成为现今研究热点之一。人们已经确定了大量存在于结肠组织、粪便或血清中的生物标记物，如癌胚抗原 (CEA)等，来用于结肠癌的早期诊断和预测，但是目前大多数推荐的筛查方法的灵敏度和特异性都在50%以下。最近，还相继报道了一些组织中、粪便中和血清中的结直肠癌分子标记，但其效果也远低于结肠镜。例如，如果用粪便DNA特异的甲基化位点作为标记，当特异度达到90%时，灵敏度只有50%。而且这种检测肯定不如血液标记物的检测方便，因此目前更多的医务工作者希望开发血液中结直肠癌诊断的标志物。有研究报道，血清结肠癌特异抗原CCSA-3和CCSA-4可能成为结直肠癌诊断的标志物，其检测效果还需证实。每年大约报道有上千种肿瘤分子标记物，但是最后应用于临床的分子标志物几乎没有，它们存在的缺陷集中在样本量较少(< 30)，没有在不同种族或独立实验中被确实等。更关键的是， 在样本收集、预处理和目标分子抽提过程中标准的不统一让这些分子标志物很难被推广。综上，由于肠镜费用较高、痛苦较大和操作要求高等原因降低了病人愿意做该项检查的程度，致使很多病人拖到晚期成了不治之症。因此急切需要开发出一种可应用于结直肠癌早期筛查的简单可靠、无创或微创的大通量检查方法。具有生物活性的溶血磷脂分子在肿瘤发生和发展中的作用日益引起科学家的关注。这其中一些溶血磷脂分子，比如LPC、鞘氨醇磷酸胆碱 (sphingosylphosphorylcholine, SPC)、溶血磷月旨酸(lysophosphatidic acid, LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-l-phosphate，SlP)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)可以调节诸如细胞增殖、迁移、形态发生和吸附在内的多种活动。因此这些溶血磷脂分子可以参与血管生成、伤口愈合、免疫、动脉粥样硬化发生和成瘤等过程的调节。这些脂类分子的代谢与上述生理病理进程息息相关，其中SPC和SM均可以转化为S1P，而LPC通过ATX催化可以生成 LPA, SlP和LPA作为功能活性脂类分子对肿瘤的调节功能十分显著。随着生物活性脂类分子与肿瘤相关性认识的深入和脂类分子检测手段的进步，一些生物活性脂类分子被认为可能作为肿瘤早期诊断的生物标记物。基于脂类分子，特别是生物活性脂类分子的重要生理和病理意义，国际上新近提出了脂类组学和功能脂类组学的概念。除现有的基因组和蛋白质组学之外，脂类组学的研究和发展必将在肿瘤的早期诊断和治疗中发挥重要的作用。此夕卜，肿瘤发生早期生物活性脂类分子代谢的异常可以从人的体液(血清/血浆)中直接检测到。与之相比，传统的组织样本检测不仅创伤大，而且对肿瘤难以做到早期诊断。与基因和蛋白标记物相比，作为代谢标记物，生物活性脂类分子的检测更方便、快捷，适于临床推广。因此，建立灵敏、准确和高效的生物活性脂类分析方法，筛选针对不同肿瘤特异的生物活性脂类分子标记物，对肿瘤早期诊断具有重要的意义。不同于蛋白质和多肽，开发针对于简单的溶血磷脂分子，如LPA和LPC的抗体非常困难。因此简单的ELISA检测方法对于这些溶血磷脂分子来说很难适用。一些传统的脂类分析方法曾被成功的应用于溶血磷脂的分析检测，如thin-layer chromatography (TLC)， phosphorous determination，禾口 gas chromatography (GC)等。{B是，这些方^去中有白勺分析过程复杂，工作量大，有的则灵敏度差，不能高效地分析体液中含量低的溶血磷脂，而且没有任何一种方法能够简单的用于分离和分析溶血磷脂的亚型。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛查或辅助筛查结直肠癌的试剂盒。本发明提供的筛查或辅助筛查结直肠癌的试剂盒，包括用于检测磷脂含量的装置和由所述磷脂含量建立的比对卡；所述磷脂为SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、 20:0LPC、22:6LPC和 22:0LPC。所述由磷脂含量建立的比对卡为如下1)或2):1)为比对卡A和比对卡B中的任意一种；2)比对卡A和比对卡B;所述比对卡A由直线1、横坐标1和纵坐标1组成；所述直线1 为 0.023X 饱和 LPC 总量+5.96X18:2LPC% +17. 06XSPC 总量= 9. 66 ；所述横坐标1 为 0. 023X 饱和 LPC 总量 +5. 96X18:2LPC% ；所述纵坐标1为SPC总量(含量)；上述直线1为纵坐标1关于横坐标1的一次函数；所述比对卡B由直线2、横坐标2和纵坐标2组成；所述直线2 为 11. 41X18:2LPC% +7. 43X 18: ILPC% +0. 024X 饱和 LPC 总量= 14. 58 ；所述横坐标2 为 11.406X18:2LPC%+7.43X18:1LPC% ；
所述纵坐标2为饱和LPC总量；上述直线2为纵坐标2关于横坐标2的一次函数；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不饱和LPC总量的百分比；所述18: ILPC含量占不饱和LPC总量的百分比。所述饱和LPC 总量为 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 禾口 22:0LPC 含量的总和；所述不饱和LPC总量为18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的总和；上述各磷脂含量的单位均为micro Μ。所述用于检测磷脂含量的装置为液质联用仪。所述液质联用仪为 Applied Bio systems S ciex 3200Qtrap mass spectrometer, Applied Biosystems Sciex, Ontario, Canada, ^^llllifffi^^ ] ^ 比为90 10 0. 1的甲醇、水、氨水混合物；所述检测采用的流动相的流速为0. 2ml/min,检测LPC、SPC、L-PAF和SM各亚类时不需要柱子，检测LPA、SlP的柱子型号为 C18HPLC column (TARGA C18 5 μ Μ, 2. Imm IDXlOmm TR-0121-C185，Higgins Analytical, Southborough, ΜΑ)。所述磷脂含量为离体血液中磷脂含量。所述试剂盒由所述用于检测磷脂含量的装置和所述由所述磷脂含量建立的比对卡组成。所述的试剂盒在制备检测待测样本结直肠癌的产品中的应用也是本发明保护的范围。所述待测样本来源于人，具体来源于亚洲人，尤其优选为中国人。本发明的实验证明，本发明在中国人群中(正常对照和肿瘤患者各120例)深入研究了一系列磷脂分子的含量(LPC，LPA, SPC, SIP, SM和溶血血小板因子L-PAF)，特别是含有胆碱基团的脂类分子(LPC、SMJP SPC)各种亚类在血浆中的含量，深入探究这些脂类在结直肠癌中的变化，进而开发有效的结直肠癌早期诊断分子标记，建立了分子检测模型，根据此模型检测的灵敏度和特异度可达88 %和80 % (或者83 %和86 % )，利用这些脂类分子对结直肠癌和正常对照的区分效果优于近些年来很多研究结直肠癌早期诊断的标志物。本发明的蹄选中，以 Electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS，三重四级串联质谱仪)为基础，开发了定量检测人血浆中溶血磷脂分子的技术。质谱检测的优点是(1)灵敏度高、重复性好；( 它不仅可以同时检测大量不同种类的脂类分子，而且可以分辨同一种脂类分子的不同亚型；(3)检测血浆样本具有取样方便、创伤小等优点，而且所需样本量只有10-50μ1 ;(4)利用一台自动取样器，这种检测技术就可以变得非常自动化。因此，这种检测方法在临床应用上具有很大的潜力。应用相关技术，2007年，美国印第安纳大学徐燕教授实验室首先报道LPC可以作为美国人群的结直肠癌早期诊断标志物。 但是对于癌症早期诊断分子标记而言，跨种族和人群的独立检测至关重要，多数分子标记在种群中存在极大差异。本发明的研究结果表明一系列含有胆碱基团的磷脂分子可以作为筛查结直肠癌的分子标记。这些脂类分子的代谢对于结直肠癌的进程起到关键作用。每年有超过100，000 篇关于“cancer marker"的文章发表，但是这些分子标志物最后被应用于临床检验的少之又少，不同实验室对同一标志物的检测结果存在诸多差异，样本收集方式差异、提取方式的差异以及复杂的检测方法等都是这些标志物难以被应用的原因。而本发明的对这些含胆碱基团的脂类分子检测过程，取样、提取和检测高度标准化，而且利用几十微升血浆和简单的有机试剂就可以准确定量这些脂类分子在血浆中的含量，可以推行到例行体检中，并将其作为结直肠癌早期诊断的筛查指标，即指血化验就有可能为结直肠癌诊断提供初步依据。
图1为饱和LPC、不饱和LPC、总LPC以及(16 0+18 0) SM含量在正常对照和结直肠肿瘤患者体内的含量变化趋势图2为利用LPC区分中国人群中正常对照与结直肠癌患者模型图3为利用LPC和SPC区分中国人群中正常对照与结直肠癌患者模型
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、筛查结直肠癌的试剂盒的构建一、分子模型的建立1、血液收集、脂类分子提取和检测1)研究对象所有样本收集于2007年5月-2010年5月，样品来自全军第二炮兵总医院、北京医院、北京大学第二附属医院。早晨取空腹病人血液进行预处理。此项目经过hstitutional Review Board审批，所有受试者签署知情同意书。表1概括了研究对象的基本情况受试健康样本和肿瘤样本中男性比例分别为 68%和59% ；健康对照和肿瘤患者的年龄分别为55. 2士7. 5和55. 7士 11. 8，取样年龄没有
显著性差异。表2概括了所取120例肿瘤样本的基本情况53% (64/120)为结肠肿瘤，其余样本大多为直肠肿瘤。超过75%的肿瘤为T3/T4期(93/120)，大约一半的肿瘤为NO (58/120， 48% )。从分化程度上看，绝大多数肿瘤为中高度分化(82/120,69% )。表1研究对象的基本情况表2癌症患
者的基本情况
权利要求
1.一种筛查或辅助筛查结直肠癌的试剂盒，包括用于检测磷脂含量的装置和由所述磷脂含量建立的比对卡；所述磷脂为 SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、 22:6LPC和 22:OLPC。
2.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于 所述由磷脂含量建立的比对卡为如下1)或2)；1)为对比卡A和比对卡B中的任意一种；2)对比卡A和比对卡B；所述比对卡A由直线1、横坐标1和纵坐标1组成；所述直线 1 为 0. 023X 饱和 LPC 总量 +5. 96X18:2LPC% +17. 06X SPC 总量=9. 66 ； 所述横坐标1为0. 023X饱和LPC总量+5. 96X18:2LPC% ； 所述纵坐标1为SPC总量； 所述比对卡B由直线2、横坐标2和纵坐标2组成；所述直线 2 为 11. 41X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% +0. 024X 饱和 LPC 总量=14. 58 ； 所述横坐标 2 为 11. 406X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% ； 所述纵坐标2为饱和LPC总量；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不饱和LPC总量的百分比； 所述18: ILPC含量占不饱和LPC总量的百分比。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述饱和 LPC 总量为 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 和 22: OLPC 含量的总和； 所述不饱和LPC总量为18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的总和。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于 所述用于检测磷脂含量的装置为液质联用仪。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述检测采用的流动相为体积比为90 10 0.1的甲醇、水、氨水混合物； 所述磷脂含量为离体血液中磷脂含量。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由所述用于检测磷脂含量的装置和所述由所述磷脂含量建立的比对卡组成。
7.权利要求1-6中所述的试剂盒在制备检测待测样本结直肠癌的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述待测样本来源于人，具体来源于亚洲人，尤其优选为中国人。
全文摘要
本发明公开了一种筛查结直肠癌的试剂盒。本发明提供的筛查结直肠癌的试剂盒，包括用于检测磷脂含量的装置和由磷脂含量建立的比对卡；所述磷脂为SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。本发明的实验证明，本发明开发有效的结直肠癌早期诊断分子标记，建立了分子检测模型，根据此模型可以检测灵敏度和特异度可达88％和80％，利用这些脂类分子对结直肠癌和正常对照的区分效果优于近些年来很多研究结直肠癌早期诊断的标志物。
文档编号G01N30/06GK102565267SQ20121000302
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者丛羽生, 宋建稳, 张俊杰, 徐燕, 李颂, 桑建利 申请人:北京师范大学