一种结直肠癌检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种结直肠癌检测试剂盒，尤其涉及一种以粪便 为检测样本的简易的结直肠癌检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目前在结直肠癌筛查上主要有两种常用技术。
[0003] -种是大便隐血试验。通常肠癌的发生演变在早期可以没有任何征兆，癌细胞可 在大肠肠壁上生长数十年再转移到其他部位，在没有任何症状前，增生的组织可渗出少量 血液，血液进入大便被排出。而大便隐血试验就是检测大便中的血液成分（检测对象是血 红蛋白），若多次、持续的阳性反应提示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发 生。该法的优点是结果显示快、清晰，结果可以半定量。但其存在一系列缺点：首先，其特异 性差，受饮食影响大。含亚铁离子的食物和药物对结果有干扰，假阳性率30%。隐血检查前， 指导患者应避免服用铁剂、动物血、肝类、瘦肉以及大量绿叶蔬菜3天，如有牙龈出血，误咽 下血性唾液，以防粪便隐血检查呈假阳性；其次，其敏感度低，出血量>90μg/ml才能检出； 再次，该方法学限制条件多：患者提前准备时间长，由于取材部位不同，反应时间不同，对显 色的判断不同，故在同一方法的试验中，也可产生误差，因此一般测试时候均要求患者采用 不同天的粪便样品连续测定。
[0004] 另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的 诊断方法。绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。它通过肛门插入可检查到直 肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠以及与大肠相连的一小段小肠（回盲末端）。 通过镜子不但可以清楚地发现肠道病变，还可对部分肠道病变进行治疗，如：大肠息肉等良 性病变镜下直接摘除，对肠道出血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。肠镜检查技术是 目前其它诊疗手段无法替代的主要手段。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效 可靠的诊断方法。然而，其也存在一系列的缺点：首先，其需要检查前准备，作肠镜需要在检 查前3天开始进食流质或少渣半流质饮食，检查当天上午空腹，检查前一天开始服用甘露 醇等导泻剂清洁肠道，服用的液体量通常高达2L，清洁灌肠以保证肠道的清洁度，之后不能 再进食。检查时医生会通过肠镜向肠腔内注入一定量气体使肠道膨大便于观察。由于结肠 结构迂回曲折，检查过程中被检查者会有不同程度的胀痛或牵拉感觉。对于过分紧张或高 度肠痉挛的受检者，则需要使用镇静剂或解痉药物。对于不能配合的小儿，则需要在麻醉下 进行。其次，其对医生的操作熟练水平有很高的要求，初学者容易在肠镜下遗漏病变部位造 成漏诊。由于检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿孔。再次，病人在检 查过程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高，较难大规模推广。
[0005] 除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。目前 已报道的（伍勇等）结直肠癌分子诊断法中，有采用粪便DNA检测并结合F0BT联合诊断的 方法，该方法需要首先对粪便中的DNA进行提取，再检测标记物APC、K-ras、p53。
[0006] 粪便是人或动物的食物残渣排泄物。粪便的四分之一是水分，其余大多是蛋白质、 无机物、脂肪、未消化的食物纤维、脱了水的消化液残余、以及从肠道脱落的细胞和死掉的 细菌，还有维生素K、维生素B、粪胆色素和尿胆素。正常情况下人的消化道上皮也会脱落一 些细胞，这些正常方式脱落的细胞进行程序性坏死，使其细胞中含有的核酸自然降解掉，所 以在正常人的粪便中基本检测不到人的核酸。但是当消化道出现病变，或者发生癌变时，消 化道内会有大量的体细胞或者癌细胞，非正常脱落。这些细胞不会启动程序性坏死程序，其 细胞内的核酸不会自发的降解掉。这些脱落的细胞随着肠道内容物向下游运动，并在肠道 菌群的作用下细胞被破坏，其中的核酸释放出来被降解成短的片段DNA。这些短片段的人 的DNA和肠道内的数以亿计的细菌以及食物残渣和代谢产物混合在一起形成粪便被排除 体外。消化道的病变越严重或者是消化道肿物体积越大和肿瘤性质越恶变，肠道内混入的 人的核酸就越多。
[0007] 李建生等研究了定量检测粪便中长DNA片段在大肠癌诊断中的意义，其公开了通 过荧光定量AluPCR检测粪便中长DNA片段，可以作为一种潜在的大肠癌筛查方法。典型 的人基因组Alu序列长282bp，由两个同源但有差别的亚基构成。限制性剪切酶AluI可将 其剪切成130bp和170bp两段，因此将其定名为Alu序列，平均每5kbDNA就有一个Alu序 列。Alu序列一般散在分布，少数呈簇状分布。在细胞遗传学水平上观察，Alu重复序列集 中在基因转录最活跃的染色体区段内。在所有已知的基因内含子中，几乎都发现了Alu序 列。由于Alu序列的特殊性，使用特异的引物对该序列扩增可以将人类的基因组DNA与非 人类基因组DNA区分开来。李建生等公开的该方法首先提取粪便中的DNA，再对其中的Alu 进行检测，其诊断大肠癌总的敏感性为46. 67 %。
[0008] 但由于粪便成份复杂，因此无法直接用PCR进行扩增。若要检测粪便中人的核酸 通常的办法是采用核酸抽提的方法，先使用机械力使粪便充分的混匀和碎裂，然后使用有 机溶剂或者是磁珠捕获的方式将全部的或者是需要的核酸富集起来，之后再经过纯化，然 后才能进行PCR扩增实验，步骤繁琐、费时。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种使用方便、前处理简单的结直肠癌检测试剂。
[0010] 本发明所提供的结直肠癌诊断试剂可以简便地以粪便作为检测样本，对结直肠癌 进行诊断。
[0011] 发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0012] 首先，发明提供了一种结直肠癌检测试剂盒，其含有Alu(Arthrobacterluteus) 检测试剂和PvPP。
[0013] 本发明与现有技术最显著的区别在于提供一种操作方式极其简单的检测试剂。其 不需要经过任何细胞破碎或DNA提取过程。这在此前的结直肠癌分子诊断中都是从未出现 过的。
[0014] 首先，发明找到了一种合适的样本，其为粪便样本，这种无创式的取样方式所获得 的样本可以通过本发明首次发现的简便方法得以检测出肠癌标记物。
[0015]目前，几乎所有的分子标记检测方法都离不开DNA的提取，而这些方法几乎都需 要使用酶类和有机溶剂，常用的DNA提取方法例如：
[0016] 一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为 100-150kb；
[0017] 二、异丙醇沉淀法：用二倍容积异丙醇替代乙醇，沉淀DNA，同时可去除小分子 RNA(在异丙醇中可溶状态）；
[0018] 三、表面活性剂快速制备法：用TritonX-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后 用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析；等等。
[0019] 而在以粪便为检测样本的分子检测方法中，由于粪便中的基质成分非常复杂，DNA 的提取更是其中必不可少的一步，并且其提取过程十分繁杂，如上述李建生等所采用的方 法，就多达20步，其需要使用多种试剂，不可或缺的例如蛋白酶K、乙醇。
[0020] 而本发明首次发现了一种可以无需进行粪便DNA提取，而是将未经DNA抽提的粪 便或粪便混悬上清液进行简单前处理再直接进行PCR扩增来实现结直肠癌标记物的粪便 检测的方法。因此本发明所提供的检测试剂盒不含酶类、有机溶剂等DNA提取试剂。这使 得其在便于操作的同时也成为一种环境友好的试剂盒。
[0021] 该技术的成功实施一方面离不开合适的结直肠癌标记物的筛选。同时，合适的前 处理方式（添加PvPP)才能进一步促进Alu的顺利扩增。
[0022] 在众多的结直肠癌标记物中，发明人成功地筛选出Alu这种标记物，其可以在合 适的条件下，无需进行粪便总DNA提取而直接以PvPP前处理的方式进行PCR扩增及检测。
[0023] 因此，发明人首次提供了一种以粪便为检测样本，可直接进行PCR扩增的结直肠 癌检测试剂盒，其含有Alu检测试剂，同时特别优选地，需要同时