一种c-kit基因d816v突变荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种C-KIT基因D816V突变荧 光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] C-KIT基因位于人染色体4ql2_13,属于原癌基因，C-KIT基因的产物是III型酪氨 酸激酶。C-KIT原癌基因表达产物C-KIT受体与其配体细胞因子结合后，可激发酪氨酸残 基磷酸化，从而调节细胞的生长，对肿瘤的增殖、恶性演进及凋亡等方面都有重要作用。针 对C-KIT研制的抑制剂格列卫（伊马替尼）是一种酪氨酸激酶抑制剂，其作用机理在于药 物结合于C-KIT蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向 底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。研究发现，约80 %的 GIST(GastrointestinalStromalTumors，即胃肠道间质瘤）有编码C-KIT受体酪氨酸激 酶受体基因的突变，在晚期GIST患者中，有C-KIT外显子11突变的患者约90%可对伊马 替尼治疗产生应答，有C-KIT外显子9突变的患者约50%可对伊马替尼治疗产生应答，并 且将伊马替尼剂量从标准的400mg提高至800mg可提高治疗应答率，C-KIT基因的多数突 变对伊马替尼产生应答，而外显子17的D816V突变却对伊马替尼产生耐药。因此，如果治 疗GIST应给予酪氨酸激酶抑制剂，则应进行肿瘤的遗传学检测，因为C-KIT特定区域的突 变与酪氨酸激酶抑制剂治疗是否应答相关。
[0003] 研究表明，由于患者基因背景的不同，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及 副反应、甚至患者的预后都存在个体差异。因此，对药物作用相关基因的检测，可指导医生 对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
[0004] 目前，采用分子生物学方法检测人C-KIT基因突变的研究主要包括测序、基因芯 片、探针杂交技术等。而随着FQ-PCR(fluorescenceQuantitative-PolymeraseChain Reaction，即荧光定量聚合酶链式反应）技术的发展，FQ-PCR技术在人C-KIT基因突变诊 断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，人C-KIT基因突变的检测中，实时荧光 PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒，以提供一 种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的C-KIT基因D816V突变检测试剂盒。
[0006] 本发明提供如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒 包括D816V突变检测反应液，且所述D816V突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核 糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探 针；所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：
[0008] 5 'FAM-CAAATCTTTGTGATCCGACCATGAGTAAGG-BHQ13 '。
[0009] 优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0010] 上游引物：5' -TCTCCTCCAACCTAATAGTGTATTCAC-3' ；
[0011] 下游引物：5 ' -CCACATAATTAGAATCATTCTTGACGT-3 '。
[0012] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为C-KIT基因中相对保守的区域 片段，且所述区域片段的序列为：
[0013] 5 '-ATCCTGCCAAGCTTTTCCTTGTTGACCGCTCCTTGTATGGGAAAGAAGACAACGACACGCTGGTCC GCTGTCCTCTCACAGACCCAGAAGTGACCAATTATTCCCTCAAGGGGTGCCAGGGGAAGCC-3'。
[0014] 优选地，所述D816V突变检测反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标 的探针的喊基对序列为：
[0015] 5 'HEX-AAGAAGACAACGACACGCTGGTCCG-BHQ13 '。
[0016] 优选地，所述D816V突变检测反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引 物；所述上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0017] 上游引物：5' -CCTTGTTGACCGCTCCTTGTA-3' ；
[0018] 下游引物：5 ' -GAGGGAATAATTGGTCACTTCTGG-3 '。
[0019] 优选地，所述10XPCR缓冲液包括pH值为7. 5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为 0. 2%的曲拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液。
[0020] 优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。
[0021 ] 优选地，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/μ1~5U/μ1的 耐热DNA聚合酶和0. 05U/μ1~0. 2U/μ1尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0022] 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为包含内标序列片段的 质粒和C-KIT基因D816V突变位点所在区域片段质粒的混合物。
[0023] 优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
[0024] 本发明所提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒包括D816V突变检测 反应液，且所述D816V突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩 增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的 C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒是基于实时荧光定量PCR技术和ARMS-PCR技术 的检测试剂盒，该检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、检测精度高，同时 在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。
【附图说明】
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0026] 图1是本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒对弱阳性 精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0027] 图2是本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒对强阳性 精密度参考品测试的扩增曲线图；
[0028] 图3是本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒对野生型 人DNA测试的扩增曲线图；
[0029] 图4是本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒对含1 % D816V突变的人DNA测试的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒，以提供一种操 作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的C-KIT基因D816V突变检测试剂盒。
[0031] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实 施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术 方案作进一步详细的说明。
[0032] 本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒包括D816V突变 检测反应液，且所述D816V突变检测反应液包括5μL的10XPCR缓冲液、0. 2mmol/L的脱氧 核糖核苷三磷酸、〇· 2μ mol/L~0· 4μ mol/L的用于扩增革E1多核苷酸的上游引物以及下游 引物和〇· 2ymol/L~0· 4ymol/L的用于检测革巴多核苷酸的探针。
[0033] 本发明通过应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索 到的C-KIT基因序列，在D816VC-KIT突变位置进行同源性比较，并针对该突变位置设计了 3套各包含有一条特异性引物ARMS引物、一条下游引物和一条探针的引物探针组合，经优 化，筛选出了扩增效果相对较好的一对用于扩增靶多核苷酸的探针和上下游引物，该探针 和引物源于人C-KIT基因D816V突变所在17号外显子区域。
[0034] 其中，该探针的碱基对序列为：
[0035] 5'-FAMCAAATCTTTGTGATCCGACCATGAGTAAGG-BHQ13' ；
[0036] 用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为：
[0037] 上游引物：5 ' -TCTCCTCCAACCTAATAGTGTATTCAC-3 ' ；
[0038] 下游引物：5 ' -CCACATAATTAGAATCATTCTTGACGT-3 '。
[0039] 本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒检测的突变位点 在检测基因的具体位置为密码子816处，且碱基的变化为GAC>GTC。由于采用了上述探针 和上下游引物，能够在50ng/反应的野生型DNA背景下实现1%突变型人C-KIT基因100% 检出且野生型人C-KIT基因零检出，说明本发明试剂盒具有很好的特异性以及极强的抗干 扰能力，大大降低了假阳性率。
[0040] 本发明实施例提供的C-KIT基因D816V突变荧光PCR检测试剂盒进一步包括内 标，即包括阳性内对照，该内标为C-KIT基因中相对保守的区域片段。在本检测试剂盒中， 该内标可以监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，进而防止样本中可能存 在的抑制物干扰检测，并使检测结果呈假阴性。其中，该内标的碱基对序列为：
[0041] 5 '-ATCCTGCCAAGCTTTTCCTTGTTGACCGCTCCTTGTATGGGAAAGAAGACAACGACACGCTGGTCC GCTGTCCTCTCACAGACCCAGAAGTGACCAATTATTCCCTCAAGGGGTGCCAGGGGAAGCC-3'。
[0042] 本发明实施例提供的D816V突变检测反应液还包括0· 1ymol/L~0· 2ymol/L 的用于检测内标的探针，该探针的碱基对序列为：5'HEX-AAGAAGACAACGACACGCTGGTCCG-B HQ13'。
[0043] 同时，本发明实施例还提供了用于扩增内标的上下游引物，该上下游引物的碱基 对序列为：
[0044] 上游引物：5 ' -CCTTGTTGACCGCTCCTTGTA-3 ' ；
[0045] 下游引物：5 ' -GAGGGAATAATTGGTCACTTCTGG-3 '。
[0046] 进一步，本发明实施例提供的检测试剂盒中的10XPCR缓冲液包括pH值为7. 5的 200mmol/L的Tris-HCl(Trishydroxymethylaminomethane，即三轻甲基氨基甲烧盐酸盐 溶液）、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.