一种用于研究Graves’病的报告基因质粒及其建立方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种用于研究Graves’病的报告基因质粒及其建立方法与应用，所述报告基因质粒包括TRAF4 3’UTR，TRAF4 3’UTR的序列如SEQ No.1所示。建立方法包括：质粒扩增、抽提、酶切、纯化回收，载体连接，转化感受态。本发明构建了含TRAF4 3’UTR野生型的报告基因质粒，建立方法简单，成本低，对质粒进行定点突变后可以用于判断miR?4443发挥抑制靶基因作用的位点，为关于miR?4443及其靶基因成为GD新的生物标志物、新靶点的研究提供了新的思路。
【专利说明】
一种用于研究Graves'病的报告基因质粒及其建立方法与 应用
技术领域
[0001 ]本发明属于Graves '病领域，特别涉及一种用于研究Graves '病的报告基因质粒及 其建立方法与应用。
【背景技术】
[0002] Graves'病(Graves'disease，GD)是一种常见的抗体介导的器官特异性自身免疫 性疾病，占甲状腺功能亢进病因的70-80 % AD临床症状明显，一旦患病持续多年，经常反 复。目前⑶的治疗方法主要包括抗甲状腺药物(antithyroid drug，ATD)、放射性Im和手术 治疗。80%患者Im治疗十年内会发展为永久性甲减，手术为有创性治疗，存在神经血管损 伤和麻醉并发症，故GD以ATD药物治疗为首选。但药物治疗有出现严重粒细胞缺少、肝损和 过敏等不良反应的风险，并且存在疗程长、复发率高、病人依从性差等问题。促甲状腺激素 受体抗体（thyrotrophin receptor antibody，TRAb)模拟TSH作用引起T3、T4合成和分泌增 加是GD临床症状产生的原因，也是治疗棘手的关键问题。因此，GD作为一种自身免疫性疾 病，探索其免疫致病机制及TRAb产生的过程，对于缩短疗程、降低复发率及提高治疗的安全 性尤为必要。
[0003] GD的发生是源于自身反应性T淋巴细胞逃逸免疫耐受，在甲状腺局部浸润并活化B 淋巴细胞产生TRAb XD4+T淋巴细胞激活与多种自身免疫性和炎症性疾病的病理过程密切 相关，主要包括1111、1112、11117、1^68、11122和1119等多种细胞亚型。研究发现1111/1112细胞比 例失调，Treg细胞/Thl7细胞的调节作用紊乱，引起促炎因子与抗炎因子的失衡，导致B淋巴 细胞的活化以及甲状腺自身抗体的产生，从而参与GD的发生、发展。激活的Thl可产生和分 泌IFN-γ，而IFN-γ可促进甲状腺细胞分泌多种趋化因子，使局部免疫炎症反应放大，在GD 发病初期发挥重要作用。Th2细胞主要通过表达IL-4、IL-5、IL-10和共刺激分子，继而促进B 淋巴细胞激活、分化为浆细胞和抗体产生。研究报道Thl7细胞在AITD的发生发展中起着重 要的作用，⑶和HT患者外周血Thl7细胞比例均显著高于正常对照者。还有研究发现在AITD 中Treg细胞对效应性T淋巴细胞的抑制作用减弱。虽然已证实多种因素通过影响⑶4+T淋巴 细胞的功能来参与GD病理过程，但GDCD4+T淋巴细胞功能异常的机制尚待进一步完善和阐 明。
[0004] miRNA是一类长度约22个核苷酸，进化上高度保守的、短小的非编码RNA，能够在转 录后水平调苄基因表达，广泛参与多种病理生理过程。近年来多有研究报道miRNA对Th细胞 分化及功能的作用。在T淋巴细胞成熟过程中miR-150表达水平明显升高，但在向Thl、Th2分 化时其表达水平迅速下降。而miR-146在T淋巴细胞成熟过程中，在Thl细胞亚群中表达升 高，Th2细胞亚群中则表达下降。在DGCR8敲除的⑶4+T淋巴细胞中，miR-29b可抑制向Thl分 化及IFNy生成。相反，miR-155通过抑制细胞因子通路的负调控因子促进Thl和Thl7依赖的 组织炎症反应，同时可下调活化CD4+T淋巴细胞表面的IFN γ受体以促进Thl细胞分化，而 miR-155缺乏的T淋巴细胞有向Th2分化的趋势。我国科学家研究发现，miR-326通过作用于 负调控Th 17分化的转录因子E t S以促进Th 17分化及IL-17的产生。多项研究表明包括11^1?-155，miR-146a，miR-17~92和miR-10a在内的多种miRNAs在Treg细胞发育及其功能发挥方 面起着非常重要的作用。比如，miR-146a在Treg细胞中表达量很高，其选择性调控由Treg细 胞介导的免疫抑制作用，此作用可抑制IFNA依赖性Thl反应活性和炎症反应过程。miRNAs通 过影响T淋巴细胞功能或分化参与了包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)在内 的多种自身免疫性疾病发生。但是尚无研究筛查⑶患者⑶4+T淋巴细胞中miRNAs表达情况， 且特定miRNA在⑶病理生理过程中的作用及机制也鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于研究Graves'病的报告基因质粒及其 建立方法与应用，本发明构建了含TRAF4 3 'UTR野生型的报告基因质粒，建立方法简单，成 本低，对质粒进行定点突变后可以用于判断miR-4443发挥抑制靶基因作用的位点，为关于 miR-4443及其靶基因成为⑶新的生物标志物、新靶点的研究提供了新的思路。
[0006] 本发明的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒，所述报告基因质粒包括TRAF4 3'UTR，TRAF4 3'UTR的序列如SEQ No.l所示。
[0007] 本发明的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒的建立方法，包括：
[0008] (1)将带有psiCheck2-null的DH5a接种于装有LB/氨苄青霉素的培养管中，然后在 37 °C摇床中培养12~16小时，扩增质粒;离心沉淀，加入细胞悬浮液、碱裂解液和中和液，经 清洗、离心得到质粒；
[0009] (2)将上述质粒经Not I和Xho頂每切，加入上样缓冲液，凝胶电泳纯化，回收；
[0010] (3)设计上下游引物，与经过步骤(2)的质粒用连接酶链接，最后采用热击法转化 感受态，即可；其中，引物序列为TRAF4 3'UTR-F:GATCGCTCGAGGTGCAGGTGGGGTTCGAGGGG; TRAF4 3 ' UTR-R:TTGCGGCCAGCGGCCGCTGTGCTGACCAGTTCATTTAATC。
[0011] 所述步骤(2)中的Not I和Xho I的酶切体系为：10XNEB buffer 2yl，Not I ΙμL， Xho I ΙμL，纯化BSA 0·2μ1，Η20 11.8yl，DNA模板ΙμL。
[0012] 所述步骤(3)中的连接酶为T4DNA连接酶。
[0013]本发明的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒的应用，用于判断miR-4443发 挥抑制靶基因作用的位点。
[0014] 有益效果
[0015]本发明构建了含TRAF4 3'UTR野生型的报告基因质粒，建立方法简单，成本低，对 质粒进行定点突变后可以用于判断miR-4443发挥抑制靶基因作用的位点，为关于miR-4443 及其靶基因成为⑶新的生物标志物、新靶点的研究提供了新的思路。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的报告基因质粒图谱；
[0017] 图2为miR-4443调控TRAF4的表达；其中，A为miR-4443与TRAF4 3'UTR的两个潜在 结合位点的序列及突变序列；B为将带有野生型或突变型TRAF4 3'UTR的质粒与NC或miR-4443mimics共转染293T细胞48小时后，检测报告基因活性;C为转染miR-4443mimics或对照 后，TRAF4mRNA和蛋白表达水平;D为转染miR-4443 inhibitors或对照后，TRAF4mRNA和蛋白 表达水平。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0019] 实施例1
[0020] 1.质粒扩增、质粒抽提、质粒检测
[0021] (1)将带有psiCheck2-null的DH5a接种于装有5ml LB/氨苄青霉素的10~20ml的 培养管中，然后在37°C摇床中培养12~16小时，以扩增质粒。
[0022] (2)取5.01111左右的菌液，于室温(20°(：左右），900(^离心1分钟以沉淀菌种。
[0023] (3)倒出或吸出培养基，往沉淀中加入250μ1细菌悬浮液P1 (含RnaselOOug/ml)，漩 涡振荡使细胞完全重新悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量十分重要的。
[0024] (4)往重悬混和液中加入250μ1碱裂解液P2,立即温和颠倒混匀5~10次。如有必 要，可把裂解液置于室温静置2~4分钟使体系变得清亮。避免剧烈混和裂解液，否则会使染 色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5分钟。当使用完碱裂解液以后， 须盖紧瓶盖保存，避免与空气中的C0 2反应。
[0025] (5)往上述混和液中加入350μ1中和液P3，温和地上下颠倒离心管5~10次，混匀， 直至形成白色絮状沉淀。混匀后冰浴5分钟，以提高质量。
[0026] (6)室温，彡12000g离心10分钟。
[0027] (7)将上清液小心移至吸附柱(一定要避免吸到沉淀），9000g离心1分钟。倒掉收集 管中的液体，把吸附管放回收集管。
[0028] (8)在吸附柱中加入250μ1的清洗液B1，静置1分钟后，9000g离心1分钟。
[0029] (9)在吸附柱中，直接加入250μ1的清洗液SW液，静置1分钟，9000g离心1分钟。倒掉 收集管中液体，将吸附柱放回收集管。
[0030] (10)在吸附柱中加入600μ1的洗涤液WGP，9000g离心1分钟。倒掉收集管中的液体， 将吸附柱放回收集管。
[0031] (11)加入250μ1的WGP液，离心2分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管， 9000g空转2分钟。
[0032] (12)将在吸附柱放入干净的1.5ml的Ep管中，加 25μ1的ddH20溶解质粒，静置5分钟 后，9000g离心1分钟，弃离心柱，收集质粒DNA。
[0033] (13)将吸附柱移入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附柱中加入T1液50μ1，室温静置 3分钟后，13000g室温离心3分钟。将ΕΡ管中收集到的DNA轻轻混匀，以NaniDrop测定浓度后 储存于-20°C。（上述步骤所用试剂均来自于protocal试剂盒）
[0034] 2.酶切以及载体纯化
[0035] 取0.2ml的PCR小管，按照下表配制酶切体系（20μ1)，冰上操作。
[0036]
[0037] PCR仪上，37Γ，孵育2~3小时。
[0038] 3.质粒载体纯化，回收
[0039] (1)制胶:胶的浓度为1.2~1.5%，把干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作 台上;调整好梳子的高度;在l〇ml 0.5 X TBE缓冲液，加入1.2-1.5g琼脂糖，在微波炉中使琼 脂糖颗粒完全溶解，冷却至45~50°C时倒入制胶板中；凝胶凝固后，小心拔去梳子把胶取 出，放入电泳缓冲槽中，加入电泳缓冲液。
[0040] (2)点样:将酶切好的质粒20μ1加2.5μ1上样缓冲液，混匀后点入加样孔，中间一孔 是DNA marker，marker-般加5~10μ1。
[0041] (3)电泳：电压140V，10~15分钟。
[0042] (4)观察：电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪中，打开电脑中的 genesnap软件，观察。可见样本有一明显条带。
[0043] (5)割胶纯化:在紫外灯下，用刀片切割含条带的胶，分别放入干净1.5ml的Ep管 中。
[0044] 4.质粒回收
[0045] (1)每管加入buffer S1 400μ1，覆盖住胶即可，最少200μ1。
[0046] (2)放入55~60度烘箱，10分钟左右，期间观察胶溶解的情况，如有碎块，可稍震荡 一下，再溶解1~2分钟。
[0047] (3)吸出已溶解的胶和buffer，放入吸附管中，离心9000g，l分钟。
[0048] (4)取出柱子，弃管中液体，然后加500μ1 buffer W1洗，9000g，离心1分钟，重复洗 一次，9000g，离心1分钟。
[0049] (5)弃液体后空转9000g，离心2分钟，更换新的Ep管，加 dd Η20,20μ1溶10分钟。
[0050] (6)9000g，离心 1 分钟。
[0051 ] 5.载体连接
[0052] (1)根据Targetscan中的miR_4443seed region以及TRAF4的3 'UTR序列，结合载体 的酶切位点设计上下游引物。引物稀释后，两管合成一管，包好，放入97-100°C开水保温壶 中过夜，第二天，自然冷却后与酶切后的质粒用连接酶链接。
[0053] TRAF437 UTR-F：GATCGCTCGAGGTGCAGGTGGGGTTCGAGGGG；
[0054] TRAF43'UTR-R:TTGCGGCCAGCGGCCGCTGTGCTGACCAGTTCATTTAATC。
[0055] (2)准备冰盒，提前拿出连接buffer(ligase buffer)。
[0056] (3)连接体系：10μ1，0·2πι1 PCR Ep管，室温(22°C)，连接 15-20分钟。
[0057]
[0058] 3.9.6转化感受态(热击法）
[0059] (1)取-80°C冰箱中的感受态DH5a菌种，置于冰上，用移液抢吹打几次混匀。
[0060] (2)取1 · 5ml Ep管，每管加入50μ1感受态和0 · 5yg质粒，吹打均匀后，冰上放置30分 钟。
[0061] (3)热击:42°C，水浴 1.5分钟。
[0062] (4)冰镇:置冰上5分钟。
[0063] (5)复苏:每管加800-1000μ1 LB培养基(提前配好，放4°C冷库保存）；吹打均匀后， 放入摇菌箱，设置160rpm摇40~60分钟。
[0064] (6)4000g，离心3分钟后，弃部分上清，留200μ1每管。
[0065] (7)取提前准备好的LB板(Amp+)，每板放入200μ1质粒，用三角玻璃棒反复轻推液 体，以接种均匀。每次三角形的玻璃板用后均浸泡在酒精中，然后在酒精灯上烧一会，凉好 再用。
[0066] (8)倒置培养皿，放入菌箱中上层，37 °C，孵育14~16小时左右。
[0067] (9)挑克隆，每个板取3-4个单克隆，每个克隆放入一个干净的小摇管中。加入3ml LB液
[0068] (Amp+)，于37°C孵箱里，250rpm摇 14~16小时，SP得psiCHECK-TRAF4 3 'UTR。
[0069] 实施例2
[0070] psiCHECK_TRAF4 3'UTR定点突变
[0071] (1)设计突变引物如下：
[0072] TRAF4 3'UTR Mutantl:mutl_F:gccaccaccctcaggtcggaggttttggtgcttcagccctgg cccc；mutl-R
[0073] ggggccagggctgaagcaccaaaacctccgacctgagggtggtggc；
[0074] TRAF4 3'UTR Mutant2:mut2_F gtttctgagctacacaggcggaggtttaccgtcactggtgaa atgc；mut2-R
[0075] gcatttcaccagtgacggtaaacctccgcctgtgtagctcagaaac〇
[0076] (2)定点突变反应：
[0077] ①如下设置基因定点突变反应体系：
[0078] Reaction Buffer(10Χ)5μ1；
[0079] 待突变模板质粒χμΚ?Ο-lOOng);
[0080] 引物-F xul(125ng);
[0081] 引物-R xul(125ng);
[0082] dNTP Mix ΙμL；
[0083] QuikSolution 试剂 1 · 5μ1;
[0084] ddH2〇 χμ1〇
[0085] 按照上述顺序依次加入各种试剂^在上述反应体系中，计算出需加入的ddH20的 量，使总体积为49微升适当混勾后，加入ΙμL QixifcChangODLightning Enzyme，混勾。
[0086] ②如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止 蒸发。
[0087] ③按照如下参数设置PCR仪：
[0088]
[0090] 说明：野生型质粒psiCHECK2-TRAF4为7630个bp，那么68°C的延伸时间为4分钟。 [0091]④Dpn I 消化
[0092] (l)PCR反应后，直接在每个PCR反应体系中加入2μ1 Dpn I限制性内切酶。
[0093] (2)用移液器轻轻地、完全地吹打混匀，将液体轻轻甩下后立即37°C孵育5min，以 消除未突变的模板〇嫩。37°(：孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。
[0094] (3)Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20°C保存备用。
[0095]⑤转化、挑克隆鉴定
[0096] (1)取-80 °C冰箱中的感受态细胞，置于冰上，用移液抢吹打几次混匀。取15ml离心 管，每管加入45μ1感受态。
[0097] (2)每管加入2μ1β_ΜΕ mix，轻轻混匀，冰上放置2分钟。
[0098] (3)将2μ1经Dpn I消化后的突变产物用于转化。为了提高转化效率可以加入ΙμL O.Olng/μΙ的pUC18。
[0099] (4)吹打均匀后，冰上放置30分钟。
[0100] (5)热击:42°C，水浴 30 秒。
[0101] (6)冰镇:置冰上2分钟。
[0102] (7)复苏:每管加800-1000μ1 LB培养基(提前配好，放4°C冷库保存）；吹打均匀后， 放入摇菌箱，设置160rpm摇40~60分钟。
[0103] (8)4000g，离心3分钟后，弃部分上清，留200μ1每管。
[0104] (9)取提前准备好的LB板(Amp+)，每板放入200μ1质粒，用三角玻璃棒反复轻推液 体，以接种均匀。每次三角形的玻璃板用后均浸泡在酒精中，然后在酒精灯上烧一会，凉好 再用。
[0105] (10)倒置培养皿，放入菌箱中上层，37°C，孵育14~16小时左右。
[0106] (11挑克隆，每个板取3-4个单克隆，每个克隆放入一个干净的小摇管中。加入3ml LB液(Amp+)，于37°C孵箱里，250rpm摇14~16小时，分别得到突变152-159位置(mutl)和 1305-1311位置(mut2)，或同时突变两个潜在结合位点(mut3)的TRAF4 3'UTR报告基因质粒 (图 2A)。
[0107] 将报告基因质粒与miR-4443mimics或NC共转染HEK293T细胞，48小时后检测荧光 素酶活性。如图2B所示，与对照相比，miR-4443mimicS显著降低WT荧光素酶活性，而将两个 潜在结合位点突变后荧光素酶活性无变化，且mut2荧光素酶活性降低较mutl多，表明miR-4443主要通过与152-159位置结合发挥基因沉默作用。
[0108] 进一步研究发现，miR-4443mimics可明显降低正常⑶4+T淋巴细胞TRAF4mRNA和蛋 白水平表达，同时miR-4443inhibitors增加初诊断⑶患者的⑶4+T淋巴细胞TRAF4表达（图 2C和D)。
【主权项】
1. 一种用于研究Graves'病的报告基因质粒，其特征在于：所述报告基因质粒包括 TRAF43'UTR，TRAF4 3'UTR的序列如SEQ No.l所示。2. -种用于研究Graves '病的报告基因质粒的建立方法，包括： (1) 将带有psiCheck2-null的DH5a接种于装有LB/氨苄青霉素的培养管中，然后在37°C 摇床中培养12~16小时，扩增质粒;离心沉淀，加入细胞悬浮液、碱裂解液和中和液，经清 洗、离心得到质粒； (2) 将上述质粒经Not I和Xho I酶切，加入上样缓冲液，凝胶电泳纯化，回收； (3) 设计上下游引物，与经过步骤(2)的质粒用连接酶链接，最后采用热击法转化感受 态，BP 可；其中，引物序列为TRAF4 3 ' UTR-F: GATCGCTCGAGGTGCAGGTGGGGTTCGAGGGG; TRAF4 3 ' UTR-R:TTGCGGCCAGCGGCCGCTGTGCTGACCAGTTCATTTAATC。3. 根据权利要求2所述的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒的建立方法，其特征 在于:所述步骤(1)中的细胞悬浮液含l〇〇ug/ml Rnase。4. 根据权利要求2所述的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒的建立方法，其特征 在于:所述步骤(2)中的Not I和Xho I的酶切体系为：10XNEB buffer 2yl，Not I lyl，Xho I ΙμL，纯化BSA 0·2μ1，Η20 11.8yl，DNA模板ΙμL。5. 根据权利要求2所述的一种用于研究Graves'病的报告基因质粒的建立方法，其特征 在于:所述步骤(3)中的连接酶为T4DNA连接酶。6. -种如权利要求1所述的用于研究Graves'病的报告基因质粒的应用，其特征在于： 用于判断miR-4443发挥抑制靶基因作用的位点。
【文档编号】C12Q1/68GK106086053SQ201610527900
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】宁光, 王曙, 王卫庆, 綦澄, 綦一澄, 张倩为, 陈欣欣
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院