一组dna分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用

一组dna分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用
【专利摘要】一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用，包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6所示。该重组菌能高效表达全基因优化的糖基转移酶基因op78D2，该酶能高效、特异性的在山萘酚3位羟基进行糖基化；同时通过强化重组菌UDP?glucose的合成途径，使重组菌能高效供应UDP?glucose，解除重组菌合成紫云英苷的瓶颈。最终通过发酵条件的优化，实现了紫云英苷的高效合成。
【专利说明】
一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷 的应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一组DNA分子及其重组质粒 和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用。
【背景技术】
[0002] 紫云英苷是一种黄酮类化合物，存在于多种植物中。如荷叶，桑叶，天山花楸叶，维 药属葵花等。紫云英苷化学学名为3，5，7，4 ' -四羟基黄酮-3-葡萄糖苷，分子式为C^HmOn， 相对分子量为448.38,其分子结构式如图-1所示。具有显著的抗氧化活性、抗炎活性、抗过 敏性、调节机体免疫力等多种药理作用。
[0003] 抗炎作用：紫云英苷能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞N0、PGE2和IL-6或TNF-a 的产生;研究表明紫云英苷能够降低牙龈卟啉单胞菌囊诱导的人牙龈上皮细胞促炎性因子 ⑶乂-2、11^-6、11^-8、1^^-1和1?0 3-3的基因表达水平，表明其是一种潜在慢性牙周炎治疗药 物。
[0004]抗过敏作用:有报道显示紫云英苷对过敏性疾病如过敏性皮炎具有很好的治疗作 用。Matsumoto等通过口服给药过敏性皮炎小鼠，发现紫云英苷可以减轻其皮炎症状，并减 少表皮水分流失。Kotani等研究发现紫云英苷可以抑制高亲和力IgE受体交联的人嗜碱白 血病细胞(KU812)组胺释放水平，减弱小鼠被动皮肤过敏反应和皮肤炎症反应，减少炎性细 胞如肥大细胞浸润，下调血液中IgE水平和脾脏T淋巴细胞对E-4和E-13分泌。
[0005] 抗氧化作用：一直以来黄酮类化合物被广泛地用作抗氧化剂使用。它能够有效地 清除活性氧自由基，并且和过氧自由基作用来终止多不饱和脂肪酸自氧化过程中的自由基 链反应。Park等证实紫云英苷能够对抗活性氧自由基，保护细胞膜免受太阳照射引起的皮 肤损伤。张银娣等研究发现紫云英苷具有抗远志皂苷引起的溶血作用和抗CC1 4肝毒作用， 同时增强小鼠红细胞内超氧歧化酶(S0D)活性，降低小鼠肝内丙二醛(MDA)和增加谷胱甘肽 (GSH)含量。Choi等研究发现紫云英苷可以有效阻止人红细胞自由基(AAPH)诱导的氧化溶 血和胞内抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)衰竭。Saito等通过高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)发现紫云英苷的清除自由基能力与其和G-C碱基对之间形成氢键来加固其与DNA之间的 嵌合能力有关。Kovganko等研究发现紫云英苷可以保护PBS溶液中过氧化氢酶不被超声裂 解，保护效果优于没食子酸丙酯和4-叔丁基儿茶酚。
[0006] 免疫调节作用：紫云英苷是增强机体免疫能力的一种有效成分。尤丽芬等研究表 明适当浓度的紫云英苷(5yg~0.05yg/mL)对人外周血NK细胞活性具有显著的促进作用，其 作用强弱与机体的免疫水平有关。张银娣等研究发现紫云英苷能够对抗环磷酰胺 (Cyclophosphamide)、 6QC0- γ射线引起的末梢血液中白细胞减少和升高氢化可的松(Hydr -Cortisone)免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞，增重脾脏和显著提高小鼠遭受应激如寒冷、高 温、缺氧时的耐力。
[0007] 目前紫云英苷主要从桑叶、仙草等通过有机溶剂提取得到粗提物，再通过柱层析、 结晶等方法获得纯品。但由于紫云英苷在植物中的含量比较低，同时植物中含有多种黄酮 类化合物成分复杂，造成提取成本过高，环境污染等缺点。近年来发展起来的合成生物学为 天然产物的合成提供了更好的解决方案。植物中存在紫云英苷的合成途径，如果能够在异 源构建紫云英苷的高效合成途径，将有望解决高效获得紫云英苷的技术瓶颈。植物合成紫 云英苷是以山奈酚为底物通过糖基转移酶以二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-glucose)为葡萄糖供 体合成紫云英苷。在异源宿主中实现紫云英苷的高效合成，首先需要获得能高效、特异性催 化山奈酸生成紫云英苷的转糖基酶;其次需要宿主能高效供应UDP-glucose。
[0008] 本发明对拟南芥、银杏、芽孢杆菌来源的5种糖基转移酶合成紫云英苷的能力进行 了比较，筛选获得了拟南芥糖基转移酶基因 78D2，该酶能高效转化山奈酚生成紫云英苷，以 山奈酚为底物时，其Km和Vmax为0.3mM和27U/mg。对该酶基因按照大肠杆菌优势密码子优 化，并利用强启动子在大肠杆菌中实习了高效表达。另一方面，通过在重组菌中强化UDP-glucose 的合成途径， 实现了UDP-glucose 的高效供应 ，进一步提高了紫云英苷的产量 。在此 基础上，对重组菌的发酵工艺进行了优化，获得了重组菌产紫云英苷的最佳发酵条件，紫云 英苷的产量达到2381mg/L，摩尔转化率为95%。通过HPD400大孔树脂层析柱分离，真空干燥 得到纯度为97%的紫云英苷精制品，紫云英苷的得率为85%。

【发明内容】

[0009] 解决的技术问题:本发明提供了一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其 产紫云英苷的应用，该重组菌能高效表达全基因优化的糖基转移酶基因〇p78D2,该酶能高 效、特异性的在山萘酚3位羟基进行糖基化；同时通过强化重组菌UDP-glucose的合成途径， 使重组菌能高效供应UDP-glucose，解除重组菌合成紫云英苷的瓶颈。最终通过发酵条件的 优化，实现了紫云英苷的高效合成。
[0010]技术方案：一组DNA分子，包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2,蔗糖磷酸化 酶基因 Basp，尿苷酰转移酶基因 ugpA和蔗糖透性酶基因 cscB，其核酸序列分别如SEQ ID N0:1，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8和SEQIDN0:6所示。
[0011] 含有上述DNA分子的一对重组质粒，拟南芥糖基转移酶基因78D2是以pGEX-2T为载 体，构建重组质粒pGEX-〇p78D2进行表达，蔗糖磷酸化酶基因 Basp，尿苷酰转移酶基因 ugpA 和蔗糖透性酶基因 cscB是以pACYCDuet-1为载体，构建重组质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA进行表达。
[0012] pGEX-〇p78D2的构建方法为：按照SEQ ID N0:1设计引物，78D2-1: CCCGGATCCATGACTAAACCGTCTGACCC和78D2-2:CCCGAATTCTTAGATGATGTTAACCACCGC;以 SEQ ID NO: 1为模板，用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95 °C，5min;暂停计时，加 Pyrobest聚合 酶，加40yL石蜡油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72°C，1 · 2min); 72°C，10min;反应停 止，4°C保温;通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，得到糖基转移酶基因 op78D2和 PGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，将连 接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克 隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-〇p78D2。
[0013] pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA的构建方法为:第一轮PCR，以E · coli W的基因组为模 板，用合成的引物cscB-12: CCACAAATCAAATCAGAAGAGTATTGCTAATGGCACTGAATATTCCATT和 cscB-2: CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95°C，5min;暂停计 时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石蜡油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72°C，1 · 5min); 72 °C，lOmin ;反应停止，4 °C保温，通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化;第二轮 PCR，以上述PCR片段为模板，用合成的引物cscB-11: CCCCCTGCATTAGGACCTATTGACAATTAAAGGCTAAAATGCTATAATTCCACAAATCAAATCAGAAG和cscB-2: CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95 °C，5min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石蜡油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72°C，1 · 5min); 72°C， lOmin;反应停止，4°C保温，通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，获得携带有启动 子的cscB基因；将获得的cscB基因和pACY⑶uet分别用EcoN I酶切，并割胶回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑 选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pACY⑶uet-cscB;
[0014] 以SEQ ID Basp-2: CCCGAATTCTTACGCAACAACTGGAGGATTG进行PCR，获得opBasp;将获得的 opBasp基因和 pACYCDuet-cscB分别用Nco I和EcoR I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，将连接 产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克隆 提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp;
[0015] 以SEQ ID 和 ugpA-2: CCCGGTACCTTAAACCCAATCGCCCGGTTC 进行 PCR，获得 opugpA;将获得的 opugpA基因 和pACYCDuet-cscB-Basp分别用Nde I和Κρη I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜， 将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确 的克隆提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp-UgpA。
[0016] 含有所述重组质粒的大肠杆菌，由以下方法制得:将重组质粒PGEX-OP78D2和重组 质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA共转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌。
[0017]上述大肠杆菌在转化山萘酚生产紫云英苷中的应用。
[0018] 上述应用的具体步骤为，将重组大肠杆菌以体积比1%的接种量接种于添加氨苄 青霉素和氯霉素抗性的LB培养基中，37°C培养OD600至2.5，添加诱导剂IPTG至0.05mM，鹿糖 至0 · 5wt · %，山萘酚至1600mg/L，37°C，180rpm全细胞转化24h。紫云英苷的产量为2381mg/ L，摩尔转化率为95%。将上述转化液离心，取上清，通过HPD400大孔树脂层析柱分离，用 90%乙醇直接洗脱，真空干燥得到纯度为97%的紫云英苷精制品，紫云英苷的得率为85%。
[0019] 有益效果：1.本发明所述的重组菌所含的糖基转移酶能高效催化山萘酚生成紫云 英苷，其Km和Vmax分别为0 · 3mM和27U/mg;
[0020] 2.本发明所述的重组菌所含的糖基转移酶能特异性在山萘酚的3位羟基进行糖基 化；
[0021] 3.本发明所述的重组菌能高效供应UDP-glucose，解除重组菌合成紫云英苷的瓶 颈；
[0022] 4.本发明所述的重组菌能高效合成紫云英苷，紫云英苷产量达到2381mg/L，摩尔 转化率为95 %，是目前报道中的最高产量；
[0023] 5.本发明所述的重组菌发酵制备紫云英苷的工艺简单。
【附图说明】
[0024] 图1为重组菌转化山萘酚生成紫云英苷的示意图；cscB表示蔗糖透性酶，Basp表示 鹿糖磷酸化酶，ugpA表示尿苷酰转移酶，78D2表示糖基转移酶，Sucrose表示鹿糖，glucose 1-phosphate表示1-磷酸葡萄糖，UDP-glucose表示UDP-葡萄糖。
[0025] 图2为重组菌高效表达糖基转移酶的电泳图;Μ表示蛋白标准品，1表示37°C诱导的 重组菌BL21-0P78D2全细胞蛋白，2表示37°C诱导的重组菌BL21-0P78D2可溶性蛋白，3表示 30°C诱导的重组菌BL21-0P78D2全细胞蛋白，4表示30°C诱导的重组菌BL21-0P78D2可溶性 蛋白，5表示20°C诱导的重组菌BL21-0P78D2全细胞蛋白，6表示20°C诱导的重组菌BL21-0P78D2可溶性蛋白，7表示纯化的重组蛋白78D2。
[0026]图3为重组糖基转移酶78D2的酶学性质研究示意图，a表示pH对酶活的影响，b表示 温度对酶活的影响。
[0027]图4强化UDP-glucose供应对重组菌合成紫云英苷的影响图；
[0028]图5转化条件对重组菌产紫云英苷的影响图，a转化温度对紫云英苷产量的影响;b 诱导剂IPTG浓度对紫云英苷产量的影响；c蔗糖浓度对紫云英苷产量的影响;d诱导时机对 紫云英苷产量的影响。
[0029]图6重组菌产紫云英苷的时间曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属 于本发明保护的范围。
[0031] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊 说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到;如无特殊说明，实施例 中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
[0032] 实施例1
[0033] 1.糖基转移酶基因的筛选
[0034] 1.1糖基转移酶基因的合成
[0035] 对拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的糖基转移酶78D2(NP_197207.1)、73B3 (ΝΡ_567953·1)和78D1(NP_564357.1)基因，银杏(Ginkgo biloba)来源的糖基转移酶UFGT (AEQ33588.2)基因和Bacillus sp.HH1500来源的糖基转移酶BTGT(AGH18136.1)基因，按照 大肠杆菌1(12优势密码子表(111^口://'?0^.1^21183.01'.」口/〇0(1〇11/)对上述基因序列进行优 化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的糖基 转移酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，获得优化后的糖基转移酶基因 op78D2,op73B3,op78Dl，opUFGT，opBTGT，其核酸序列分别为SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2， SEQIDN0:3，SEQIDN0:^PSEQIDN0:5**。
[0036] 1.2重组质粒的构建
[0037] 重组质粒pGEX-〇p78D2的构建：
[0038] 按照优化后的基因序列SEQ ID NO: 1设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。 78D2-1:CCCGGATCCATGACTAAACCGTCTGACCC和78D2-2:CCCGAATTCTTAGATGATGTTAACCACCGC。 以优化合成的基因序列SEQ ID N0:1为模板用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95°C， 5min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石錯油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72 °C，1.2min) ;72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯 化。得到糖基转移酶基因〇p78D2和pGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶 回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进 行序列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-〇p78D2。
[0039] 重组质粒pGEX-〇p73B3的构建：
[0040] 按照优化后的基因序列SEQ ID N0:2设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。 73B3-1:CCCGGATCCATGAGCAGCGATCCGCATCG和73B3-2:CCCGAATTCTTAGCTGGTGAACTCTTCAAT。 以优化合成的基因序列SEQ ID N0:2为模板用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95°C， 5min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石錯油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72 °C，1.5min) ;72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯 化。得到糖基转移酶基因〇p73B3和pGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶 回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进 行序列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-〇p73B3。
[0041 ] 重组质粒pGEX-〇p78Dl的构建：
[0042] 按照优化后的基因序列SEQ ID N0:3设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。 78D1-1:CCCGGATCCATGACCAAATTCAGCGAACC和78D1-2:CCCGAATTCTTAAACTTTAACAATTTCAT。以 优化合成的基因序列SEQ ID N0:3为模板用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95°C，5min; 暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石蜡油密封;35次循环(94°C，50s;51°C，90s;72°C， 1.5min) ;72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。 得到糖基转移酶基因〇p78Dl和pGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶回 收，浓缩后16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行 序列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-〇p78Dl。
[0043] 重组质粒pGEX-opUFGT的构建：
[0044] 按照优化后的基因序列SEQ ID N0:4设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。 UFGT-1:CCCGGATCCATGGAAAATGGTAATCGTAA和UFGT-2:CCCGAATTCTTATGCTGCTTCCATGCTAA。以 优化合成的基因序列SEQ ID N0:4为模板用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95°C，5min; 暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石蜡油密封;35次循环(94°C，50s;51°C，90s;72°C， lmin); 72°C，10min;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得 到糖基转移酶基因 opUFGT和pGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶回收， 浓缩后16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序 列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-opUFGT。
[0045] 重组质粒pET-opBTGT的构建：
[0046] 按照优化后的基因序列SEQ ID N0:5设计引物，引物由上海生物工程有限公司合 成。BTGT-1:CCCCATATGGCAAATGTTCTGGTTAT和BTGT-2:CCCCTCGAGTTTAATTTTAACATACGGTT。以 优化合成的基因序列SEQ ID N0:XX为模板用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95°C， 5min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石錯油密封;35次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72 °C，lmin); 72 °C，1 Omin;反应停止，4 °C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。 得到糖基转移酶基因 opBTGT和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收， 浓缩后16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序 列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pET-opBTGT。
[0047] 1.3糖基转移酶基因转化山奈酚生成紫云英苷能力的比较
[0048] 分别将上述重组质粒 pGEX-〇p78D2，pGEX-〇p73B3，pGEX-〇p78Dl，pGEX-〇pUFGT 和 pET-opBTGT转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌（Novagen)，分别得到重组菌BL21-0P78D2， BL21-0P73B3，BL21-0P78D1，BL21-0PUFGT 和 BL21-0PBTGT。在含有氨苄青霉素（50yg/mL)的 LB平板(LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37°C培 养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中（50yg/mL氨苄青霉素)37 °C，200rpm振荡培养至OD600 为0.6时，加入终浓度为0.1 mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)诱导剂，和0.5g/L的山 奈酚，20°C转化24h。山萘酚及紫云英苷的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为： Agilent 1260Infinity;DAD检测器检测波长为368nm，柱温为40 °C，流动相流速为0.8mL/ min(A:甲醇，B:l%甲酸水=55:45，1511^11)。结果表明含有糖基转移酶7802基因的重组菌转 化能力最强(表1)。
[0049]表1不同来源糖基转移酶转化能力的比较
[0050]
[0051 ] 2.糖基转移酶78D2的纯化及定性
[0052] 2.1糖基转移酶78D2的表达条件优化
[0053] 将重组质粒pGEX-〇p78D2转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有氨苄 青霉素 GOyg/mL)的LB平板(LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂 15g/L)上经过37 °C培养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中（50yg/mL氨苄青霉素）37 °C， 200rpm振荡培养至0D6(x)为0.6时，加入终浓度为0.1 mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG) 诱导剂，分别20 °C培养16h，30 °C培养1 Oh，37 °C培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4°C 下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，并通过蛋白电泳检测糖基转移酶78D2的重组表达。 结果表明，20°C，0.1 mM IPTG诱导能有效减少重组菌包涵体的产生，实现糖基转移酶78D2可 溶性高效表达(图2)。
[0054] 2.2糖基转移酶7802的纯化
[0055] 将重组质粒pGEX-0P78D2转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有氨苄 青霉素(50yg/mL)的LB平板上经过37 °C培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中（50yg/mL 氨苄青霉素)37 °C，200rpm振荡培养至0D6QQ为0.6时，加入终浓度为0.1 mM异丙基β-D-硫代吡 喃半乳糖苷（IPTG)诱导剂，20°C诱导培养16h，用高速冷冻离心机将培养液在4°C下，以13， OOOrpm离心15min，收集菌体。由于重组质粒pGEX-〇p78D2中含有谷胱甘肽GST标签，通过 GST-Sefinose? Kit(上海生工)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：
[0056] A.样品的处理
[0057] (1)将洗涤过的菌体，用1 XBinding Buffer 20mL重悬，超声波破壁。
[0058] (2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。
[0059] 处理柱子
[0060] (1)用10mL的无菌水洗柱子。
[0061 ] (2)用10mL的 1 XBinding Buffer洗柱子。
[0062] C.上样
[0063] (1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。
[0064] (2)用10mL 1 XBinding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。
[0065] (3)用5mL 1 XEluting Buffer洗脱液洗柱子，获得目标蛋白。
[0066]通过此过程得到纯化的糖基转移酶78D2,纯化的糖基转移酶78D2的纯度鉴定采用 SDS-PAGE方法进行，结果如图2所示。
[0067] 3.糖基转移酶78D2的酶学性质研究 [0068] 3.1酶活测定
[0069] 反应体系100yL，10yL 500mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH 8·0)，2yL 50mmol/L的UDP-glucose，10yL 2mmol/L的山萘酚，先在35°C孵育5min，再加入 10 yL酶液(稀释到合适的倍数)反应10min，加入400yL甲醇终止反应，山萘酚及紫云英苷的测 定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为:Agilent 1260Infinity;DAD检测器检测波长为 368nm，柱温为40°C，流动相流速为0.8mL/min(A:甲醇，B: 1 %甲酸水=55:45，15min)。酶活 力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生Ιμπιο?紫云英苷所用的酶量为1个酶活力单 位。
[0070] 3.2最适反应温度
[0071] 在25-50°C范围内，每隔5°C，分别测定酶活。缓冲为50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，发现糖基转移酶78D2的最适反应温度为35°C (图3)。
[0072] 3.3最适反应pH
[0073] 在不同的pH(7.0-9.5，50mmol/L Tris-HCl缓冲液)条件下，35°C分别测定酶活，发 现糖基转移酶78D2的最适反应pH为7.5(图3)。
[0074] 3 · 4Km 和 Vmax
[0075] 在pH 8.0,35°C最适条件下，以不同浓度的山萘酚为底物，测定酶活，再以双倒数 作图法获得糖基转移酶78D2对山萘酚的米氏常数Km为0.3mM，最大反应速度Kmax为27U/mg。
[0076] 4.重组质粒 pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA 的构建
[0077] Sucrose permease基因（cscB，ADT76024.1)是通过PCR从大肠杆菌E.coli W的基因 组中扩展获得，而E.coli W的基因组是从DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)购买获得。通过2 轮PCR使cscB基因上游携带有中等强度的启动子和核糖体结合位点，具体核酸序列信息如SEQ ID N0:6所示。第一轮PCR，以E.coli W的基因组为模板，用合成的引物cscB-12: CCACAAATCAAATCAGAAGAGTATTGCTAATGGCACTGAATATTCCATT和cscB-2: CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95°C，5min;暂停计时，加 Pyrobest 聚合酶，加 40yL5 蜡油密封;35 次循环(94°C，50s; 51°C，90s; 72°C，1 · 5min); 72°C，10min;反应停止， 4°c保温。通过凝胶回收试剂盒对rar增产物进行纯化。第二轮PCR，以上述PCR片段为模板，用合成 的引物cscB-11: CCCCCTGCATTAGGACCTATTGACMTTAMGGCTAAMTGCTATMTTCCACAMTCAMTCAGM G和cscB-2: CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95 °C，5miη;暂 停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40yL石蜡油密封；35次循环（94°C，50s ; 51°C，90s ; 72°C， 1.5min) ;72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。 获得携带有启动子的cscB基因。将获得的cscB基因和pACY⑶uet分别用EcoN I酶切，并割胶 回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进 行序列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pACY⑶uet-cscB。
[0078] Suer〇 s e pho sphory 1 ase gene ( Basp，WP_0 1 1 742626 · 1 )基因来源于 Bifidobacterium adolescentis，按照大肠杆菌K12 优势密码子表（http:// www.kazusa.or. jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高 的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公 司合成，获得优化后的基因 opBasp，其核酸序列为SEQ ID N0:7。以优化后的序列为模板，以 合成的引物Basp-1:CCCCCATGGGCAAAAACAAAGTTCAG 和Basp-2: CCCGAATTCTTACGCAACAACTGGAGGATTG进行PCR，获得opBasp。将获得的opBasp基因和 pACYCDuet-cscB分别用Nco I和EcoR I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，将连接 产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克隆 提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp 〇
[0079] UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase gene(ugpA,YP_003971086.1) 基因来源于Bifidobacterium bif idum，按照大肠杆菌K12优势密码子表（http : // www.kazusa.or. jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高 的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公 司合成，获得优化后的基因 opugpA，其核酸序列为SEQ ID N0:8。以优化后的序列为模板，以 合成的引物ugpA-l:CCCCATATGTTTGCGGAGGATCTGAAACG 和 ugpA-2: CCCGGTACCTTAAACCCAATCGCCCGGTTC进行PCR，获得opugpA。将获得的opugpA基因和 pACYCDuet-cscB-Basp分别用Nde I和Κρη I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，将 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的 克隆提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp-UgpA 〇
[0080] 5.重组菌BL21-II的获得
[0081 ] 将重组质粒pGEX_op78D2和重组质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA共转化大肠杆菌 BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有氨苄青霉素（50yg/mL)和氯霉素(40yg/mL)的LB平板 (LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37°C培养过 夜，获得重组菌BL21-11。
[0082] 6.重组菌(BL21-0P78D2)和重组菌(BL21-II)转化能力比较
[0083] 分别将重组菌(BL21-0P78D2)和重组菌(BL21-II)以体积比1%接种量接种于添加 合适抗性的LB培养基中，37 °C培养0D6QQ至0.8，添加1 %的蔗糖，0.1 mM IPTG，山萘酚至0.5g/ L，20°C，180rpm全细胞转化24h，分别测定转化率，结果发现重组菌（BL21-II)是重组菌 (BL21-0P78D2)产量的2倍，如图4所示。
[0084] 7.转化条件的优化
[0085] 7.1转化温度对重组菌(BL21-II)转化山萘酚生成紫云英苷的影响
[0086] 将重组菌以体积比1 %接种量接种于LB培养基中，37°C培养OD600至0.8，添加诱导 剂IPTG为O.lmM，山萘酚至1600mg/L，蔗糖浓度为1%，转化温度分别为20,30,37,40,45和50 °C，180rpm全细胞转化24h，分别测定紫云英苷的产量，结果发现转化温度为37°C时，紫云英 苷的产量最高，如图5a所示。
[0087] 7.2IPTG用量对重组菌(BL21-II)转化山萘酚生成紫云英苷的影响
[0088] 将重组菌以体积比1 %接种量接种于LB培养基中，37°C培养OD600至0.8，添加诱导 剂 IPTG 分别为0,0.05,0.1，0.2,0.4和0.811^，山萘酚至160011^/1，蔗糖浓度为1%，37°(：， 180rpm全细胞转化24h，分别测定紫云英苷的产量，结果发现添加0.05mM IPTG时，紫云英苷 的广量最尚，如图5b所不。
[0089] 7.3蔗糖浓度对重组菌(BL21-II)转化山萘酚生成紫云英苷的影响
[0090] 将重组菌以体积比1 %接种量接种于LB培养基中，37°C培养OD600至0.8，添加诱导 剂IPTG为0.05mM，山萘酚至 1600mg/L，蔗糖浓度分别为0，0.1，0.5，1，2和4%，37°C，180rpm 全细胞转化24h，分别测定紫云英苷的产量，结果发现添加0.5 %蔗糖时，紫云英苷的产量最 尚，如图5c所不。
[0091] 7.5诱导时机对重组菌(BL21-II)转化山萘酚生成紫云英苷的影响
[0092] 将重组菌以体积比1 %接种量接种于LB培养基中，37°C培养OD600至0 · 4，0 · 8，1 · 5， 2.5和3，分别添加诱导剂IPTG为0.05mM，山萘酚至1600mg/L，蔗糖浓度为0.5 %，转化温度分 别为37°(：，180印111全细胞转化2411，分别测定紫云英苷的产量，结果发现006()()至2.5是诱导， 紫云英苷的产量最高，如图5d所示。
[0093] 8.紫云英苷的制备
[0094] 将重组菌（BL21-II)以体积比1%接种量接种于500mL的LB培养基中，37°C培养 0D6QQ至2.5左右时，添加诱导剂IPTG为0.05mM，山萘酚至1600mg/L，蔗糖浓度为0.5 %，转化 温度分别为37°C，180rpm全细胞转化24h，诱导后分别在0,2,4,8，12,2处取样测定紫云英苷 的产量，24h后紫云英苷的产量为2381mg/L，摩尔转化率为95%。紫云英苷生成的时间曲线 如图6所示。
[0095]将转化24小时后的样品，6000g离心，收集上清，将获得的上清直接上柱，层析柱的 填料为HPD400大孔树脂(直径为5cm，柱长为30cm)，层析柱用去离子水平衡，上样完成后，用 15倍体积的去离子洗层析柱，随后用90%的乙醇进行洗脱，获得的样品真空干燥得到纯度 为97%的紫云英苷精制品，紫云英苷的得率为85%。
【主权项】
1. 一组DNA分子，其特征在于包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因似，蔗糖磷酸化酶 基因你邓，尿苷酰转移酶基因收W和蔗糖透性酶基因 osM其核酸序列分别如SEQ ID NO: 1，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8和SEQIDN0:6所示。2. 含有权利要求1所述DNA分子的一对重组质粒，其特征在于拟南芥糖基转移酶基因 76?堤以pGEX-2T为载体，构建重组质粒pGEX-〇p78D2进行表达，蔗糖磷酸化酶基因你印，尿 苷酰转移酶基因和蔗糖透性酶基因是以pACYCDuet-Ι为载体，构建重组质粒 pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA 进行表达。3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于pGEX-〇p78D2的构建方法为：按照SEQ ID NO : 1 设计引物，78D2-1 : CCCGGATCCATGACTAAACCGTCTGACCC和 78D2-2 : CCCGAATTCTTAGATGATGTTAACCACCGC;以SEQ ID NO: 1为模板，用合成的引物进行PCR，扩增的 条件是95°C，5 min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40 錯油密封;35次循环（94°C， 50 s;51°C，90 s;72°C，1.2 min );72°C，10 min;反应停止，4°C保温;通过凝胶回收试剂盒 对PCR扩增产物进行纯化，得到糖基转移酶基因似和pGEX-2T分别用和f 进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受 态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒PGEX-op78D2。4. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA的构建方 法为：第一轮PCR，以五.W的基因组为模板，用合成的引物cscB-12: CCACAAATCAAATCAGAAGAGTATTGCTAATGGCACTGAATATTCCATT 和cscB_2: CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95°C，5 min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40 yL石蜡油密封;35次循环（94°C，50 s;51°C，90 s;72°C，1.5 min );72°C，10 min;反应停止，4°C保温，通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化;第二 轮PCR，以上述PCR片段为模板，用合成的引物cscB-11: CCCCCTGCATTAGGACCTATTGACAATTAAA GGCTAAAATGCTATAATTCCACAAATC AAATCAGAAG 和cscB-2:CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATAT AGAGC进行PCR，扩增的条件是95°C，5 min;暂停计时，加 Pyrobest聚合酶，加40 錯油密 封;35次循环（94°C，50 s;51°C，90 s;72°C，1.5 min );72°C，10 min;反应停止，4°C保温， 通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，获得携带有启动子的基因；将获得 的d基因和pACYCDuet分别用EcoN I酶切，并割胶回收，浓缩后16 °C连接过夜，将连接产 物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克隆提 取质粒，获得重组质粒pACYCDuet-cscB; 以SEQ ID NO: 7为模板，以合成的引物Basp-1: CCCccATGggcAAAAACAAAGTTCAG和Basp-2: CCCGAATTCTTACGCAACAACTGGAGGATTG进行PCR，获得opBa s/7;将获得的 opBa s/7基因和 pACYCDuet-cscB分别用Nco I和EcoR I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，将连接 产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确的克隆 提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp; 以SEQ ID NO: 8为模板，以合成的引物ugpA-1: CCCCATATGTTTGCGGAGGATCTGAAACG和 ugpA-2: CCCGGTACCTTAAACCCAATCGCCCGGTTC进行PCR，获得;将获得的 基因 和pACYCDuet-cscB-Basp分别用Nde I和Κρη I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜， 将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析;挑选序列正确 的克隆提取质粒，获得重组质粒pACYO)uet-cscB-Basp-UgpA。5. 含有权利要求2所述重组质粒的大肠杆菌，其特征在于由以下方法制得:将重组质粒 pGEX-〇p78D2和重组质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA共转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组 大肠杆菌。6. 权利要求3所述大肠杆菌在转化山萘酚生产紫云英苷中的应用。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于将重组大肠杆菌以体积比1%的接种量接种 于添加氨苄青霉素和氯霉素抗性的LB培养基中，37°C培养OD600至2.5，添加诱导剂1?16至 0.05 mM，鹿糖至0.5wt·%，山萘酸至 1600 mg/L，37°C，180 rpm全细胞转化24 h。
【文档编号】C12P19/60GK106086046SQ201610405275
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】裴建军, 董萍, 赵林果, 解静聪
【申请人】南京林业大学