一株重组大肠杆菌及其在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因重组工程菌及其应用，尤其设及一种用于发酵生产[2Fe2S]铁氧 还蛋白的重组大肠杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 铁氧还蛋白是一类含铁硫簇的酸性蛋白，其中的铁硫簇又主要分为[4化4S]、 [2Fe2S]、[3Fe4S]等类型。铁氧还蛋白作为一种常见的电子载体，参与呼吸作用、光合作用、 发酵等重要代谢过程。目前，商业上出售的只有来自渡菜的巧化2S]型铁氧还蛋白，然而因 物种差异，该铁氧还蛋白在分析来自其他物种的酶的时候表现出不同的效率，且该蛋白价 格非常昂贵，运在很大程度上限制了铁氧化还原蛋白的应用和科学家对铁氧还蛋白相关的 酶和代谢过程的研究。
[0003] 在已有的文献报道中，大部分铁氧还蛋白是从野生细菌等生物体中纯化获得的， 也有通过异源表达来制备，但运些方法具有很多不足，比如消耗大量的时间，纯化步骤繁 琐，表达量低，铁氧还蛋白的铁硫簇组装不完整而活力较低，最终产量和纯度较低等。基于 此，研究和开发能够高效表达巧化2S]铁氧还蛋白的方法成为目前亟待解决的课题，经检 索，有关能够高效表达巧化2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其在发酵生产巧化2S]铁氧 还蛋白中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效表达2Fe2S铁氧还蛋白的重 组大肠杆菌及其应用。
[0005] 本发明所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌 巧scherichiacoli)pCodonPlus/p服ISC/祀TDuet-S33 [2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌 农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核巧酸序列如 SEQIDNO. 1所示；所述重组大肠杆菌是将巧化2S]铁氧还蛋白基因连接入祀TDuet-1载 体，制得重组质粒命名为祀TDuet-巧化2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和 P服ISC质粒的E.coliC41 (DE3)中获得。
[0006] 本发明所述的重组大肠杆菌在发酵生产巧化2S]铁氧还蛋白中的应用。
[0007] 其中，所述重组大肠杆菌发酵生产巧化2S]铁氧还蛋白的方法是：
[0008] (1)将重组大肠杆菌菌株W体积比1~5%的接种量接种到含有抗生素和铁硫源 的TB培养基中，在37 ±rC和180 ± 1化pm转速条件下培养2~3小时至孤62。?为0. 4~ 0.6,获得菌液；
[0009] 其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：T巧ptone12g/LYeastextract 24g/l，Glycerol4ml/l，KH2PO42. 3g/l，K2HPO4I2. 5g/L;
[0010] 上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终 浓度为100μg/ml的氨节青霉素；
[0011] 上述铁硫源配方及组分终浓度是：巧樣酸铁锭0.2-0. 3g/l，心半脫氨酸 0. 1-0. 2邑/1，巧樣酸铁 0. 18-0. 3g/l，i^S〇4· 7&0 0. 25-0. 4g/L;
[001引 似向制得的菌液中加入终浓度为0. 5mM的IPTG，在16~37°C和180±1化pm转 速下诱导2. 5~24小时，收集培养液离屯、，获得含巧化2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细 胞；
[0013] (3)破碎细胞，分离纯化制备巧化2S]铁氧还蛋白。
[0014] 上述的应用中，步骤（2)所述IPTG优选在35~37°C和18化pm转速下诱导10~ 24小时。
[0015] 步骤（3)中破碎细胞的方法是：将离屯、后获得的含巧化2S]铁氧还蛋白的重组大 肠杆菌细胞用含10%甘油的缓冲液A重悬后，采用超声波破碎仪器进行细胞破碎，12,000 转/分钟离屯、30min，取上清液用0. 22um孔径滤膜过滤，即获得含有组氨酸标签的巧化2S] 铁氧还蛋白粗酶液。
[0016] 步骤（3)中分离纯化制备巧化2S]铁氧还蛋白的方法是：
[0017] 儀柱纯化：将制得含有组氨酸标签的巧化2S]铁氧还蛋白粗酶液经过上样柱进入 儀柱中，上样速度为2ml/min。上样结束，用缓冲液A冲洗儀柱，去除杂蛋白。再用缓冲液A 和B按一定比例混合，进行梯度洗脱，收集目的蛋白。将纯度不够的蛋白用缓冲液C浓缩洗 涂，进行DEAE柱纯化，用缓冲液C和D按一定比例混合，进行梯度洗脱，收集目的蛋白。
[0018] 洗脱出来的蛋白用浓缩管进行浓缩，并用洗涂缓冲液洗涂蛋白，SDS-PAGE观察蛋 白的大小及纯度，用考马斯亮蓝法测蛋白含量，用分光光度计对蛋白进行全波长扫描。
[0019] 最后得到纯化好的蛋白在厌氧条件下低溫储存。
[0020] 活性测定：分别用氨化酶和NfnAB两种酶测定纯化出来的铁氧还蛋白的活性。 [002U上述缓冲液A的配方是：憐酸钢20mM，化Cl0. 5M，pH7. 4。
[0022] 上述缓冲液B的配方是：憐酸钢20mM，化Cl0. 5M，咪挫500mM，pH7. 4。
[002引上述缓冲液C的配方是：憐酸钢50mM，pH7. 0。
[0024] 上述缓冲液D的配方是：憐酸钢50mM，IM化Cl，pH7. 0。
[0025] 上述步骤所有操作过程均在厌氧操作箱中进行，所有溶液均进行煮沸后脱气厌氧 处理。
[0026] 本发明成功构建了能够表达带有组氨酸标签的[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠 杆菌，它的应用就是大家熟悉的大肠杆菌中异源表达的方法，不需要大量培养产铁氧还蛋 白的野生菌，节省了大量的时间，节约了成本。
[0027] 本发明的重组大肠杆菌种含有的pCodonPlus与P服ISC质粒和诱导时加入的铁硫 源促进了蛋白上铁硫簇的合成，活力强表达量高，使巧化2S]铁氧还蛋白最终产量显著提 升。实验证实：通过SDS-PAGE观察蛋白纯度较好，大小与预期的相符；每升培养物最终可W 获得23mg纯化后的巧化2S]铁氧还蛋白，远大于报道中的野生菌中纯化的0.03mg^ ;蛋白 进行全波长扫描后在325,415和456nm处有特征吸收峰（见图1)，说明铁硫簇构建比较完 整，获得的融合标签的铁氧还蛋白具有与野生蛋白相同的活性。活性检测中分别测得氨化 酶的比活为12. 5 + 1.8U/mg，NfnAB的比活为33.8+ 4.lU/mg。预示本发明提供的重组大肠 杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0028] 图1 :为本发明所述重组大肠杆菌表达的带有组氨酸标签的巧化2S]铁氧还蛋白 全波长扫描图。
[0029] 其中：在325,415和456皿处显示有特征吸收峰。
[0030] 图2 :为本发明所述重组大肠杆菌表达的带有组氨酸标签的巧化2S]铁氧还蛋白 SDS-PAGE电泳图。
[0031] 其中，Μ表示蛋白marker，1表示目的蛋白在大肠杆菌中异源表达后的粗酶液，2表 示儀柱纯化后的巧化2S]铁氧还蛋白，3表示DEAE柱纯化后的蛋白。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例对本
【发明内容】
作进一步阐述。
[0033] 本发明中所用菌株、材料及来源说明：
[0034]含pCodonPlus和P服ISC质粒的E.coliC41 (DE3)细胞由Dr.YasuhiroTak址as hi(大阪大学）构建和提供，其中pCodonPlus和E.coliC41(DE3)分别来自Stratagene公 司和Lucigen公司。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33由山东大学王书宁筛 选，保存于中国典型培养物保藏中屯、，编号为CCTCCM206131。
[0035] 质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化 科技（北京）有限公司。QIAampDNAMini试剂盒、Mi址lutePCR纯化试剂盒购自Qiagen公 司。Wizard基因组DNA纯化试剂盒购自Promega公司。祀TDuet-1载体购自Novagen公司。 高保真化stP化DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。祀ASY-Blunt克隆载体购 自北京全式金生物技术有限公司。E.coliMach1-T1细胞购自Invitrogen公司。内切酶、 T4DNA连接酶购自Thermo公司。义用的儀柱为HisTrapHPColrnnn，购自GEHealthcare 公司。
[0036] 实施例1 :高效表达AgrobacteriumtumefaciensS33中的[2Fe2S]型铁氧还蛋 白的重组大肠杆菌的构建
[0037] 取AgrobacteriumtumefaciensS33细胞，按照细菌基因组DNA提取试剂盒推荐 方法，从AgrobacteriumtumefaciensS33细胞中提取基因组DNA。
[0038] 根据已知的根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33基因组中[2Fe2S]型 铁氧还蛋白基因序列如SEQIDNO. 1所示，设计引物如下：
[0039]F引物：5'CGCGGATCCGATGACAAAACTGACAATCGTTGC3'
[0040]R引物：5'CCCAAGCTTTCAGCCCTGGCGCTCAGGAAC3'
[0041]W提取的AgrobacteriumtumefaciensS33基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获 得巧化2S]型铁氧还蛋白基因。PCR反应体系如下：
[0042] 加H:0 71Lii F化脚'u锭冲液 20μ1 !0niMclNTPs 2μ1 2〇μΜΡ引物 1.5 μ1
[0043] 20μΜ民引物 21.5 μ1 .化化也化'似7'""!化从7'州.、' S33语!人|如.日ΝΑ 2 μ1 FastPfu DNA polymerase 2 μ1
[0044] PCR反应条件为：
[0045] 95°C5min
[0046] 95°C30s，55°C30s，72°C30s30 个循环
[0047] 72°ClOmin
[0048] 4°C保溫
[0049]PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步确认正确后，用DNA纯化回收试剂盒纯化。将纯化 的PCR产物与祀TDuet-1载体分别用BamHI和Hindlll在37°C酶切20分钟，酶切体系如 下：
[0050] DNA 80ul Green Buffer lOul ///円cUll Sul 5ul
[0051]用DNA纯化回收试剂盒回收后进行连接，连接反应体系如下：
[0052] 目的基园的PC民产物 4μ1 pETDud-i哉体 4.5 μ1 Τ4DNA连接酶 0.5 μ1 Τ4DNA连接酶缓冲液 1