生产l-组氨酸的方法及其专用重组菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及生产L-组氨酸的方法及其专 用重组菌。
【背景技术】
[0002] L-组氨酸是人和动物的第九种必需氨基酸，参与机体生长发育、抗氧化和免疫调 节等重要的生理过程，是重要的药用氨基酸，可用于心脏病、贫血、胃肠溃疡治疗的输液制 剂。目前，L-组氨酸生产主要采用以猪(牛)血粉为原料的蛋白质水解提取法，然而，蛋白质 水解提取法存在原料成本高且利用率低、提取工艺复杂和环境污染大等缺点，使得L-组氨 酸的生产成本高，价格昂贵。微生物发酵法生产L-组氨酸尚未得到大规模的工业化应用。 L-组氨酸的生物合成具有与核苷酸合成竞争前体物质、复杂的代谢调控机制以及合成过程 中高能量需求等特点，导致其工程菌的产酸水平和转化率相对较低。L-组氨酸生产菌株的 选育主要采用多轮传统诱变筛选和在诱变菌株的基础上进行基因工程改造的方法。通过诱 变筛选获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营 养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用。目前通过系统代谢工程改造构建 L-组氨酸工程菌的研究仅有一篇报道。该研究是以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌，通过 在hisG基因中引入E271K突变，减弱组氨酸对其反馈抑制调节；敲除组氨酸合成操纵子的 转录弱化因子hisL，上调组氨酸合成操纵子的表达；同时敲除purR基因，增加组氨酸合成 前体PRPP的合成，构建了一株产L-组氨酸的工程菌。该研究只进行了 L-组氨酸终端合成 途径的改造，其L-组氨酸的产量仅为4. 9g/L，与实现工业化应用存在较大差距。
[0003] 通过失活糖酵解途径的6-磷酸葡萄糖异构酶，能够将碳代谢流导向戊糖磷酸途 径，但会导致菌株的生长和葡萄糖代谢能力的减弱而不利于菌株在发酵生产中的应用。前 期的研究结果证实，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi导致菌株的生长和葡萄糖代谢 能力的严重下降，同时L-组氨酸产量也随之下降。另外，还发现单独提高6-磷酸葡萄糖脱 氢酶的表达量，对于L-组氨酸产量提高的效果不佳。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供生产L-组氨酸的方法及其专用重组菌。
[0005] 本发明提供的构建重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异 构酶的表达，且提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组 菌。
[0006] 上述方法中，所述降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达通过如下A)或B)方 式实现：
[0007] A)失活所述出发菌染色体的pgi基因；所述失活具体为敲除；
[0008] B)将所述出发菌中的pgi基因的调控元件替换为低转录和低表达活性的调控元 件实现；
[0009] 所述提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达通过如下C) 或D)方式实现：
[0010] C)增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数；
[0011] D)将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu 启动子，且将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为PS()d启动子。
[0012] 上述方法中，所述构建重组菌的方法为如下I或II :
[0013] I所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，且增加所述出发菌中 zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数，得到重组菌；
[0014] II所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，将所述出发菌染色体上的 tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启动子、且将所述出发菌染色体上的 prsA基因的启动子替换为PS()d启动子。
[0015] 上述方法，
[0016] 所述敲除为将含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段导入所述出发菌中进行 同源重组；
[0017] 所述增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数为将zwf-opcA基因 和prSA-hisGffc片段通过重组载体导入所述出发菌；
[0018] 上述重组载体为将zwf-opcA基因和prsA_hisGfte片段插入表达载体得到的重 组载体；所述表达载体可以为IPTG诱导型表达载体pXMJ19或枯茗酸诱导型表达载体 PWYE1233 ；
[0019] 在本发明的实施例2中，重组载体为pXMJ19-ZWf-〇pcA-prsA-hisG fbl:，为将 zwf-opcA基因（序列2)插入pXMJ19的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfbl:片段 (序列3)插入Xba I和Sma I位点间得到的载体。
[0020] 在本发明的实施例4中，重组载体为pWYE1233-zwf-〇pcA-prsA-hisGfbl:，为将 zwf-opcA基因（序列2)插入pWYE1233的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfto片 段(序列3)插入Xba I和Sma I位点间得到的载体；其中，pWYE1233为将Ph(M-CymR-P_片 段(序列8)插入质粒pXMJ19的Nar I和Hind III酶切位点间得到的载体，命名为重组质 粒PWYE1233。
[0021] 所述将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为 Peftu启动子为将含有Peftu启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组；
[0022] 所述将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为PS()d启动子为将含有P S()d 启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组。
[0023] 上述方法中，
[0024] 所述含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段的核苷酸序列为序列表中的序列 1 ;基因pgi的核苷酸序列为序列11 ;
[0025] 所述zwf-opcA基因的核苷酸序列为序列表中的序列2;
[0026] 所述prSA-hisGfbl:片段的核苷酸序列为序列表中的序列3;
[0027] 所述重组载体为将所述zwf-opcA基因和所述prSA-hisG fbl:片段插入表达载体得 到的载体；
[0028] 所述Peftu启动子的核苷酸序列为序列表中的序列10自5'末端第635-834位核苷 酸；
[0029] 所述含有Prftu启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列10;
[0030] 所述含有PS()d启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列9。
[0031] 上述方法中，所述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将细菌染色体上的L-组 氨酸合成操纵子的启动子替换为PglyA启动子，且将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突 变，得到出发菌；
[0032] 所述L-组氨酸合成操纵子为hisEG和hisDCB;
[0033] 所述PglyA启动子的核苷酸序列为序列表中序列4的第863-1052位核苷酸或序列 表中序列5的第752-941位核苷酸；
[0034] 所述点突变为将所述细菌染色体的hisG基因编码的蛋白的第215位天冬酰胺变 为赖氨酸、第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸。
[0035] 上述方法中，所述将细菌染色体上的L-组氨酸合成操纵子的启动子替换为？ 81_启 动子为将含有hisEG的PglyA启动子的片段和含有hisDCB的PglyA启动子的片段导入细菌中 进行同源重组；其中，含有hisEG的P glyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列4; 含有hisDCB的PglyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列5。
[0036] 上述方法中，所述将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突变为将序列6所示的 核苷酸序列导入所述细菌中进行同源重组，再将序列7所示的核苷酸序列导入中间菌中进 行同源重组。
[0037] 上述方法中，所述细菌为棒杆菌属细菌，所述棒杆菌属细菌具体为谷氨酸棒杆菌。
[0038] 由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
[0039] 上述的重组菌在制备L-组氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
[0040] 本发明还提供一种制备L-组氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养上述的重组 菌，即得到L-组氨酸。
[0041] 本发明所述的失活细菌的pgi基因，"失活"指的是相应被改造的对象发生变化，从 而达到一定的效果，包括但是不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。
[0042] 本发明所用的染色体基因敲除、插入失活、基因敲入、启动子替换和定点突变的方 法是通过自杀性载体pKISmobsacB携带改造靶基因的同源臂发生同源重组实现的。
[0043] 本发明所述的L-组氨酸工程菌，发酵24小时的L-组氨酸生产强度为0. 01~lg/ L/h，发酵结束时的L-组氨酸产量为0. 5~50g/L。
[0044] 本发明的实验证明，与现有的L-组氨酸工程菌和L-组氨酸发酵生产方法相比，本 发明的优点在于：
[0045] (1)本发明根据代谢工程原理，首次以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌，采用分子生 物学技术，构建了遗传背景清楚的L-组氨酸基因工程菌。
[0046] (2)本发明所提供的L-组氨酸工程菌，通过采用敲除pgi基因阻断上游糖酵解途 径的同时过表达zwf-opcA基因增强戊糖磷酸途径的代谢能力的组合改造策略，工程菌的 生长和葡萄糖消耗能力与野生型菌株相比未见明显减弱，L-组氨酸产量显著提高。
[0047] (3)本发明所提供的L-组氨酸工程菌无营养物质缺陷表型，便于工业化控制。
[0048] (4)本发明所提供的L-组氨酸工程菌的发酵周期短，易于过程和成本控制。
[0049] (5)本发明首次提出了在pgi基因缺失的基础上，同时增强6-磷酸葡萄糖脱氢 酶的表达的组合改造策略，解除了 pgi基因缺失导致的菌株生长和葡萄糖代谢的限制，能 够最大程度地将中心碳代谢流导向戊糖磷酸途径，同时维持细菌较高的生长代谢和ATP水 平，显著提高L-组氨酸的产量，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-组氨酸。
[0050] 本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-组氨酸的发酵产量的 方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-组氨酸， 便于推广应用。
[0051] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0052] 另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文 内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
【附图说明】
[0053] 图1为重组质粒pXMJ19-prsA-hisGfbl:的示意图
[0054]图 2 为重组质粒 pXMJig-zwf-opcA-prsA-hisG1^ 的不意图
[0055] 图3为L-组氨酸工程菌CG171表达蛋白的SDS-PAGE图
[0056] 图4为L-组氨酸工程菌CG171中6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活性测定图
[0057] 图5为L-组氨酸工程菌CG171的发酵罐发酵过程曲线图
[0058] 图6为重组质粒pWYE1233的示意图
【具体实施方式】
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业