专利名称：一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2,3-丁二醇生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株基因重组菌及其应用，具体的说，涉及一株重组的能将2R，3R-丁 二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)基因(少々丄)和NADH氧化酶基因(wojc)共表达的大肠杆 菌，并以应用此工程菌高效转化内消旋2,3-丁二醇(meso-BD)生产S-乙偶姻(S-AC), 2R，3R-丁二醇(2R,3R-BD)生产R-乙偶姻(R-AC)的方法及拆分2，3-丁二醇(2,3-BD) 混合物生产2S,3S-丁二醇(2S,3S-BD)的方法。
背景技术：
乙偶姻(Acetoin， AC)通常为淡黄色液体或晶体，有两种同分异构体(R-AC和 S-AC)，天然地存在于葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和虹醋栗等物质中。国 家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料，FEMA安全号为2008。 AC在食品、 香料以及化妆品等行业也有着非常重要的用途Opdyke 1979。AC还是化学合成中的 重要原材料。例如，手性纯的AC可用于合成一种新的有光学活性的a-羟基酮类衍生物， 还能合成液晶材料，如手性的近晶材料和向列材料Saitoetal. 1992。
2，3-丁二醇(2,3-BD)在常温下是一种无色无味透明的液体，有三种同分异构体 meso-BD、 2R,3R-BD禾H 2S,3S-BD。 2,3-BD广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天 等各个领域Syu 2001。具有光学活性的2,3-BD (2R,3R-BD和2S,3S-BD)除了以上 用途外，由于具有低冰点(一6(TC)，可用作防冻剂；另外，由于具有手性碳原子，其 在不对称合成中也有重要用途。
1998年，英国Witwatersrand大学的Martin Studer等应用经过10,11-二氢金鸡纳 (HCD)改性的铂作为催化剂选择性的加氢还原双乙酰(diacetyl, DA)Studer et al. 1998。产品对映体过量值为85% 90%，但反应产率只有30%。英国Hull大学的 Slipszenko等也开展了采用铂催化剂选择性的催化加氢还原DA的研究Slipszenko et al. 1998，其产率为85%， R-AC的对映体过量值ee达70y。。催化加氢为非均相反应，其 反应是在高压下进行，设备要求高，而且反应所用催化剂是价格昂贵的重金属，对于催 化剂的制备、改性以及中毒、再生等系列问题尚未解决，目前尚处于实验室研究阶段， 还不能工业化。
1992年，美国的Hummel等应用微生物菌体中的酶作为生物催化剂进行还原反应Hummd et al. 1992。该方法是先培养乳酸杆菌或酵母菌以获得双乙酰还原酶 (diacetyl reductase, DAR;此酶也称BDH)，并在pH值为5、温度为70。C的条件下， 应用该还原酶及辅酶NADPH催化DA还原为AC，其产率最高达100%。这种利用还 原酶进行还原反应的优势十分明显，可以获得高选择性、高产率的产品。这一方法虽可 获得高选择性、高产率的产品，但关键步骤是要能够培养出反应所需的DAR，并且DA 对于菌体的毒性非常高，采用细胞转化法不可行；纯酶过程又非常烦琐复杂，且辅酶 NADPH的再生问题较难解决；DAR能够继续将产生的AC还原为2，3-BD，使得手性 AC的得率非常低Xiao and Xu 2007。
2001年，Syu综述了近年来生物法生产2，3-BD方面的进展，指出不同的菌株发酵
4一般会得到2,3-BD三种构型中的两种，同时得到两种构型的ACSyu2001。肺炎克 雷伯氏菌(A7eZw7'e〃a/7"ew附o附'ae)禾口产气肠杆菌(五"feraZ)a"e -aerage"es)发酵，是以 meso-BD为主要代谢物，另外还有少部分的2S,3S-BD;而多粘类芽孢杆菌(P"e"沾a"'〃w /w/少w"fl)发酵，则主要得到2R,3R-BDNakashimadaetal. 2000。因此，单纯的采用 一种野生菌株进行发酵生产难以得到手性纯的AC和2S,3S-BD。近年来对AC和2,3-BD 的研究逐步转向分子生物学和酶学方面。研究发现，AC和2，3-BD的代谢中有三个关键 酶a-乙酰乳酸合成酶(a-acetolactate synthase, ALS)、 a-乙酰乳酸脱羧酶(a-acetolactate decarboxylase, ALDC)和2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase, BDH)。其中， 不同微生物体内的BDH有着立体特异性Uietal. 1984, 1986。因此，人们尝试在大肠 杆菌(&c/^n'c/7/aco//)中外源表达来自生产菌株的这些关键酶，从而合成各种纯度高 的手性化合物。Ui等将《./wewwo"/ae编码ALS、 ALDC和meso-BDH的基因簇整合到 ￡. co// JM109中进行表达，可以将葡萄糖转化为纯的meso-BD( 17.7 g/L)，随后又将BDH 的编码基因敲除，可以得到手性纯的R-AC (17.5 g/L)Uietal. 1997, 1998。1999年， Ui等将K / "ewmow'ae的meso-BDH编码基因在￡. co// JM109中表达，可以将丁二酮转 化为S-AC，此后又将短杆菌(&eW^c^"/MWMCc/wra/j^cww)的2S，3S-BDH编码基因 整合到该菌中，可以得到2S，3S-BD，结果每3g/L的丁二酮可至多分别得到2,2g/L的 S-AC和2S,3S-BDUi et al. 1999, 2004。Yamada-Onodera2002等研究者报道从 /7"m^ra/"po/;ww;7/wDl-l中克隆的丙三醇脱氢酶基因，构建大肠杆菌工程菌，利用3g 干细胞/L， 24 h转化110 mM (9.9 g/L)的2,3-BD，生成9.9 g/L的手性AC;拆分9.9 g/L 的2,3-BD混合物(meso-BD:2R,3R-BD:2S,3S-BD-78:17:15)生成1.35 g/L的2S,3S-BD。
从Ui等的研究历程可以发现 一方面，采用构建基因工程菌的方式获得纯的手性化合
物是可行的；另一方面，手性纯化合物的生产效率不高。以葡萄糖为底物生产纯的 meso-BD， R-AC产量相对较高，但效率较低(转化率<27%);而利用丁二酮为底物生 产S-AC时，由于其对菌体的毒害作用，不可能得到高的产物浓度；利用丙三醇脱氢酶 的大肠杆菌，没有解决辅因子再生问题，也不可能达到高的产物浓度。因此，有必要继 续寻找更好的方法，以实现手性纯AC的高效生产。
5ac/〃m ra6"fc 168的基因己被证明编码2R,3R-BDH酶[Nicholson, 2008， 2R,3R-BDH催化2R,3R-BD和R-AC之间的转化，同时可催化meso-2,3-BD和S-AC之 间的转化，但不能以2S,3S-BD为底物Gonz6lezeta1.，2000。2，3-BD转化为AC的同 时使得NAD变为其还原态NADH，丄ac/o^c/〃w 6"Ws中的NOX，具有催化NADH生 成NAD的能力，实现NAD的再生Geueke et al., 2003。但2R,3R-BDH基因(j4工) 和NADH氧化酶基因("ox)在￡. "//中的共表达，并以此工程菌高效转化meso-BD 生产S-AC, 2R,3R-BD生产R-AC及拆分2，3-BD混合物生产2S，3S-BD的方法还未见 报道。
参考文献
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发明内容
针对上述现有方法中，产品的生产率低，成本高，难以大规模生产的不足。本发明 要解决的问题是构建一株能将2R,3R-丁二醇脱氢酶(2R,3R-BDH)基因(;^^)和NADH氧化酶基因(朋x)共表达的大肠杆菌，并以应用此工程菌高效转化meso-BD生产S-AC， 2R,3R-BD生产R-AC及拆分2,3-BD混合物生产2S，3S-BD。本发明所述应用的方法具 有底物价格低廉，转化效率高，操作简单，可以不同构性的2，3-BD及其混合物为底物， 分别得到R-AC， S-AC及2S,3S-BD的特点。
本发明所述基因重组菌，含有2R,3R-丁二醇脱氢酶(2R,3R-BDH)基因和 NADH氧化酶基因(朋x);该菌株名为大肠埃希氏菌￡. co/ZBL21(pETDuet-;^丄朋x); 菌株已于2008年12月23日保藏于"中国典型培养物保藏中心"(武汉大学，中国.武 汉)，保藏号为CCTCCNO: M 208259。
其中，上述菌株含有的2R，3R-丁二醇脱氢酶的;^/Z基因序列长度为1041个碱基， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示；含有的NADH氧化酶的"ox基因序列长度为1353 个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
上述重组大肠埃希氏菌co//BL21(pETDuet-_y々7:"o;c) CCTCC NO: M 208259，为 革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化meso-BD生产S-AC;催化2R,3R-BD 生产R-AC;拆分2,3-BD混合物生产2S,3S-BD。
上述重组大肠埃希氏菌co" BL21(pETDuet-;^丄"ox) CCTCC NO: M 208259的较 佳培养温度为37±1°C，可以在含有100 pg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。
本发明所述的基因重组菌--大肠埃希氏菌co/z' BL21(pETDuet-y々Z"ox)
CCTCC NO: M 208259在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化2R,3R-BD生产手性 纯R-AC及拆分2,3-BD混合物生产手性纯2S,3S-BD中的应用。
如上述的应用，其涉及的实施步骤如下 (1 )平板培养将菌株大肠埃希氏菌co// BL21 (pETDuet-;;々丄朋x) CCTCC NO: M 208259划线到含有质量体积比为1.5 1. 8%琼脂的并含100 pg/mL氨苄青霉素的LB 平板上，37土1。C培养12土1小时；
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5 mL的含100 pg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1°C摇床 振荡培养12士1小时；
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1 3%的 接种量，接种到30 mL~500 mL含有100 pg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 土1。C摇床振荡培养10±1小时；
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6 10%的 接种量接种到2L 10L的改良的M9液体培养基中，37士1。C培养5 20小时，加入终 浓度为1 mM的IPTG， 10 37°C诱导5 24小时，培养过程中，检测细胞的转化能力， 当细胞的转化能力达到4 26U/ml，停止发酵；
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5g/L; NaC110g/L， pH7.0; 115°C灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HPO4.7H20 12.8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0.5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0.011 g/L; 葡萄糖4g/L; 115°C灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是将培养的细胞悬浮于含有10 g/L的meso-BD 的200 mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37°C摇床反应20分钟，以12000 rpm的转速对反应液离心1 min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量；
上述测定体系是140 pl0.5%w/v的肌酸，200 ^5。/。w/v溶于95W乙醇的a-萘酚， 200 ^ 40% w/v的氢氧化钾，200 Ml上述离心所得上清；将该测定体系25°C放置15分 钟，然后利用分光光度计测定595 nm下的吸光度值；转化能力定义为每分钟催化底 物meso-BD生成1 pmol的AC的细胞量为1U;
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8，000土500转/分钟离心15分钟； 并用pH7.4、 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体2 3遍，然后将细胞悬起到0.85%的生理 盐水中，使细胞的终浓度为2 10g/L;将菌体置于4。C的冰箱中冷冻保存，即得到生物 催化剂，待用,-
(6) 转化实验制备产物
以浓度为2~10 g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH 5.0 10.0条件下， 转化浓度为10-60 g/L的meso-BD; 180转/分钟振荡5 30小时，得到含S-AC的转化 液；将所得的转化液，以8,000土500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物催化剂， 然后在8(TC进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度及光学 纯度；
或者，以浓度为2~10 g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH5.0 10.0条 件下，转化浓度为10~60 g/L的2R,3R-BD; 180转/分钟振荡5 30小时，得到含R-AC 的转化液；将所得的转化液，以8,000土500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物 催化剂，然后在80'C进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓 度及光学纯度；
或者，以浓度为2 10g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH5.0 10.0， 180 转/分钟振荡5 30小时条件下，拆分浓度为5~30 g/L的混合重量比例为meso-BD : 2R，3R-BD : 2S,3S-BD=75.0 : 12.6 : 12.4的2,3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限 公司)；将所得的转化液，以8,000±500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物催 化剂，然后在8(TC迸行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S，3S-BD的 浓度及光学纯度。
上述转化产物的检测方法
每500 ml乙酸乙酯中加入lml的异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对步骤(6) 中转化产物的样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡1分钟，然后静 置，取上层样品进行气相检测。具体气相检测条件如下
对于样品中底物丁二醇和产物乙偶姻浓度的检测条件如下
所用气相色谱仪的型号是VarianCP3380，氮气作为载气，进样器和检测器的温度 均设为280。C;检测过程的柱温设定为40。C保持3分钟，然后以每分钟30。C的速率 升温到260。C;利用进样器准确吸取上述处理样品的上清1^L，进行气相检测；
对于上述样品中丁二醇和乙偶姻光学纯度的检测条件如下
所用气相色谱仪的型号是Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均 设为280。C;检测过程的柱温设定为40。C保持3分钟，然后以每分钟1.5。C的速率升 温到80°C，接着以每分钟0.5。C的速率升温到86°C，以每分钟30°C的速率升温到200°C; 利用进样器准确吸取3 |uL上述处理样品的上清，进行气相检测。
8S-AC的ee值的计算方法
[相
xl00%
[小w
R-AC的ee值的计算方法
xl00%
上述的应用方法中，
步骤(4)所述诱导培养温度优选10。C 30。C;诱导培养时间优选10 20h。 步骤(4)所述细胞的转化能力优选当达到10 20U/ml，停止发酵。 步骤(6)所述转化实验优选以浓度为3.0 8.0 g干细胞/L的生物催化剂，在20°C 40°C， pH 6.0 9.0， 180转/分钟振荡6 20小时条件下对底物进行转化。 步骤(6)所述meso-BD的浓度优选10-45 g/L 。 步骤(6)所述2R,3R-BD的浓度优选10~45g/L 。 步骤(6)所述2,3-BD混合物的浓度优选10 20g/L。
本发明是一种利用含2R,3R-丁二醇脱氢酶基因(y《丄)和NADH氧化酶基因(朋x) 的重组大肠埃希氏菌￡. co// BL21(pETDuet吵c/,朋x) CCTCC NO: M 208259全细胞作为 生物催化剂催化meso-BD生产S-AC;催化2R,3R-BD生产R-AC及拆分2,3-BD混合 物生产2S,3S-BD。
本发明涉及的2R,3R-BDH基因来自^ c/〃w wto'fo 168 (购自美国标准生物 品保藏中心，菌株编号为ATCC 23857)， NOX基因"ox来自jLtf"oZwc/〃w Z^Wj (购 自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC 6004)， NOX的作用是提供 2R,3R-BDH所需的辅因子NAD。
本发明涉及的利用含2R,3R-BDH和NOX酶的￡. co/Z全细胞作为生物催化剂转化 2,3-BD生产手性AC及拆分2,3-BD混合物生产2S,3S-BD的方法转化原理可用下式表
本发明具有以下特点-.
(1) 首次构建并应用了可表达2R,3R-BDH和NOX酶的重组大肠埃希氏菌￡.
BL21(pETDuet-y力丄朋x) CCTCC NO: M 208259全细胞作为生物催化剂 转化2,3-BD生产手性AC及拆分2,3-BD混合物生产2S,3S-BD。
(2) 2R,3R-BDH催化2，3-BD生成手性AC; NOX提供2R,3R-BDH所需的辅因子NAD，实现辅因子的再生。
(3) 菌株要求的培养基简单、成本低。
(4) 直接用完整的重组大肠埃希氏菌co// BL21(pETDuet-3^丄"ox) CCTCC NO: M 208259细胞作为生物催化剂进行转化，操作方便。
(5) 本发明的生物催化剂能转化meso-BD生产S-AC;转化2，3-BD生产R-AC， 实现手性AC的生产，ee值》96%。
(6) 本发明的生物催化剂能拆分2,3-BD混合物生产2S，3S-BD，实现手性 2S，3S-BD的生产，ee值》98%。
(7) 本发明的生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续精馏分离提取费用 低廉，手性AC浓度可达36 g/L以上。
本发明所述菌株己于2008年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学， 中国.武汉)，保藏中心编号为CCTCCNO: M 208259。
图1重组大肠埃希氏菌的蛋白电泳图，M: Marker; 1: ￡. co//BL21 (DE3); 2: co// BL21 (pETDuet); 3: co//BL21 (pETDuet-少々'丄)；4: co/f BL21 (pETDuet-"ox); 5: ￡. co//BL21(pETDuet-W丄"ox)。
图2标准品的气相色谱(GC)图谱，其中异戊醇为内标，其它各物质的保留时间 分别为- R-AC, 15.340 min; S-AC， 16.836 min; 2S，3S-BD， 33.609min; 2R,3R-BD， 34.475 min; meso-BD， 36.343 min。
图3催化meso-BD生产S-AC转化液的GC图谱，(A)底物meso-BD; (B)转化液。
图4催化2R,3R-BD生产R-AC转化液的GC图谱，(A)底物2R,3R-BD; (B)转化液。
图5拆分2,3-BD混合物生产2S,3S-BD转化液的GC图谱，(A)底物2，3-BD混合 物；(B)转化液。
具体实施例方式
实施例1:重组基因工程菌株五.co/;BL21(pETDuet-3^丄"ox)CCTCCNO: M 208259的
构建
1、 2R,3R-BDH基因(>^丄)的克隆
采用常规的方法制备菌株^ C77/w 168的基因组DNA，该过程可参考科学
出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取5^///1 168的基因组DNA;使用合成的引物从S"d〃M ra^/to 168的基因组DNA中PCR 扩增得到丁二醇脱氢酶基因;^y2;
^^7/z^rato'fol68作为j^Z基因的来源菌，根据已测序的该菌的基因组序列，设计 引物上游弓l物5'-TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3'，携带一个NcoI位点； 下游引物5'-GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3'，携带一个Sail位点。
2、 NADH氧化酶基因(wx)的的克隆
采用常规的方法制备菌株丄a"o^c/〃M 6wv"的基因组DNA，该过程可参考科学 出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取 丄acto6ac/〃M 6wWs菌株的基因组DNA;使用合成的引物从Ztf"oto"〃M ^ew'5菌株的 基因组DNA中PCR扩增得到NADH氧化酶基因"ox;
10Z^cto6"c/〃船6w曲作为wx基因的来源菌，根据已测序的该菌的基因组序列及报道 的该基因的序列，设计引物
上游引物5'-GCGAGATCTCATGAAAGTCACAGTTG-3'，携带一个BglII位点； 下游引物5'-GATCTCGAGTTAAGCGTTAACTGAT -3'，携带一个Xhol位点。 3、将步骤(1) PCR扩增得到的片段连接到pEasy-T上，得到重组质粒pEasy-T)喊'丄， 将步骤(2)扩增得到的片段链接到pMD19-T上，得到重组质粒pMD19-TVwx;使用 Ncol、 salI双酶切质粒pETDuet和pEasy-T〕4i:，回收片段j;々X及pETDuet，连接，得 到重组质粒pETDuet3^2;使用BglII、 Xhol双酶切pMD19-T"ox和pETDuet;4'Z，回 收片断ww及pETDuet;^X，连接，得到重组质粒pETDuetO^lwox);再将上述重组质 粒经过转化导入宿主￡. cc^BL21(DE3)，得到工程菌株co/!' BL21(pETDuet-j喊Z朋x)。 该菌株在含100 pg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养4小时，加入终浓 度为1 mM的IPTG， 30°C诱导8小时，得到同时表达有2R,3R-BDH和NOX的细胞， 经12.5%的SDS-PAGE验证，结果如图1所示。
上述菌株已于2008年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中 国.武汉)，保藏中心编号为CCTCCNO: M 208259。
上述重组大肠埃希氏菌五.co//BL21(pETDuet-y^L"ox)CCTCCNO: M 208259，为 革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化meso-BD生产S-AC;催化2R,3R-BD 生产R-AC;拆分2,3-BD混合物生产2S,3S-BD。
上述重组大肠埃希氏菌￡. co// BL21(pETDuet-j喊Z"ox) CCTCC NO: M 208259的较 佳培养温度为37± rc，可以在含有100吗/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。
实施例2:全细胞催化剂的制备
(1) 平板培养将重组大肠埃希氏菌五.co//BL21(pETDuet->^L"ox)CCTCCNO: M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5%琼脂并含100 pg/mL的氨苄青霉素LB平 板上，37。C培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5 mL的含100吗/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37°C摇床振荡培养 12小时。
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2%的接 种量，接种到30 mL~500 mL含有100吗/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 摇床振荡培养10小时。
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8%的接 种量接种2L 10L的改良的M9液体培养基，37°C培养10小时，加入终浓度为1 mM 的IPTG， 20°C诱导12小时，使细胞的转化能力达到15 U/ml。
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5g/L; NaCl 10g/L， pH7.0; H5。C灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HPO4.7H20 12.8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0.5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0.011 g/L; 葡萄糖4 g/L; U5。C灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是将培养的细胞悬浮于含有10 g/L的meso-BD的200 mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37°C摇床反应20分钟，以12000 rpm的转速对 反应液离心1 min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是140 ^ 0.5% w/v的肌酸，200 ^ 5% w/v溶于95%乙醇的a-萘酚， 200 ^ 40% w/v的氢氧化钾，200 ^上述离心所得上清；将该测定体系25°C放置15分 钟，然后利用分光光度计测定595 mn下的吸光度值；转化能力定义为每分钟催化底 物meso-BD生成1 pmol的AC的细胞量为1U。
(5)收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用 pH 7.4、 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85%的生理盐水中， 使细胞的终浓度10g/L;将菌体置于-20。C的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待 用。
实施例3:全细胞催化剂的制备
(1) 平板培养将重组大肠埃希氏菌co" BL21(pETDuet吵力'丄"ox) CCTCC NO: M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5%琼脂并含100 pg/mL的氨苄青霉素LB平 板上，37。C培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5mL的含100吗/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37°C摇床振荡培养 12小时。
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2%的接 种量，接种到30 mL~500 mL含有100吗/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 摇床振荡培养10小时。
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8%的接 种量接种2L 10L的改良的M9液体培养基，37。C培养14小时，加入终浓度为1 mM 的IPTG， 10°C诱导20小时，使细胞的转化能力达到20 U/ml。
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5g/L; NaCl 10g/L， pH7.0; 115°C灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;
Na2HPO4,7H20 12.8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0.5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0.011 g/L; 葡萄糖4g/L; 115°C灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是将培养的细胞悬浮于含有10 g/L的meso-BD 的200 mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37°C摇床反应20分钟，以12000 rpm的转速对 反应液离心1 min,以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是140 nl 0.5% w/v的肌酸，200 nl 5% w/v溶于95%乙醇的cc-萘酚， 200 m1 40% w/v的氢氧化钾，200 pl上述离心所得上清；将该测定体系25°c放置15分 钟，然后利用分光光度计测定595 nm下的吸光度值；转化能力定义为每分钟催化底 物meso-BD生成1 pmol的AC的细胞量为1U。
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用 pH7.4、 1/15的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85%的生理盐水中，使 细胞的终浓度10g/L;将菌体置于-20。C的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用。实施例4:全细胞催化剂的制备
(1 )平板培养将重组大肠埃希氏菌￡. co// BL21(pETDuet-;^Z"ojc) CCTCC NO: M 208259菌株划线到含有质量体积比为1.5%琼脂并含100 pg/mL的氨苄青霉素LB平 板上，37。C培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5mL的含100吗/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37°C摇床振荡培养 12小时。
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2%的接 种量，接种到30 mL~500 mL含有100 pg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 摇床振荡培养10小时。
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8%的接 种量接种2 L-10 L的改良的M9液体培养基，37°C培养18小时，加入终浓度为1 mM 的IPTG， 30°C诱导6小时，使细胞的转化能力达到10 U/ml。
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5g/L; NaCl 10g/L， pH7.0; 115°C灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;
Na2HPO4-7H20 12.8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0.5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0.011 g/L; 葡萄糖4g/L; 115°C灭菌15分钟。
上述细胞的转化能力的测定方法是将培养的细胞悬浮于含有10 g/L的meso-BD 的200 mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37°C摇床反应20分钟，以12000 rpm的转速对 反应液离心1 min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量。
上述测定体系是140^11 0.5% w/v的肌酸，200pl5。/。w/v溶于95y。乙醇的a-萘酚， 200 pl 40% w/v的氢氧化钾，200 ^上述离心所得上清；将该测定体系25°C放置15分 钟，然后利用分光光度计测定595 nm下的吸光度值；转化能力定义为每分钟催化底 物meso-BD生成1 pmol的AC的细胞量为1U。
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8,000转/分钟离心15分钟；并用 pH 7.4 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍，最后将细胞悬起到0.85%的生理盐水中， 使细胞的终浓度8 g/L;将菌体置于-20。C的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待 用。
实施例5:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌co/z'BL21(pETDuet-;^i:"ojc) CCTCCNO: M208259的细胞浓度为5 g干细胞/L,在20。C， pH9.0条件下，meso-BD 浓度为25g/L; 180转/分钟振荡反应IO小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化 液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中meso-BD和 S-AC的含量；
反应结束时收集转化液在8(TC进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产 物中S-AC的浓度为23.5 g/L，其ee值为96.2%。该样品的GC图谱见图3，保留时间 为16.836的峰即是S-AC的峰。
13实施例6:利用实施例2~4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验将所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌￡. co/Z BL21(pETDuet-)^'丄"ox) CCTCCNO: M 208259的细胞浓度为3 g干细胞/L，在30°C， pH8.0条件下，meso-BD 浓度为10g/L; 180转/分钟振荡反应6小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化液， 以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在80'C进行减压蒸馏，馏 份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度为9.5 g/L，其ee值为96.8%。
实施例7:利用实施例2~4得到的生物催化剂制备S-AC
转化实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌co/z'BL21(pETDuet->^'Z"ox) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为8 g干细胞/L，在40°C， pH6.0条件下，meso-BD 浓度为45 g/L; 180转/分钟振荡反应20小时，得到含S-AC的转化液；将所得的转化 液，以8，000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中meso-BD和 S-AC的含量；
反应结束时收集转化液在8(TC进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产 物中S-AC的浓度为36.7 g/L，其ee值为％.0%。
实施例8:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌co/z'BL21(pETDuet-;^'Z朋x) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为3 g干细胞/L，在30°C， pH 8.0条件下，2R,3R-BD 浓度为10 g/L; 180转/分钟振荡反应6小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化液， 以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在8(TC进行减压蒸馏，馏 份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度为9.5 g/L，其ee值为96.8%。该样 品的GC图谱见图4，保留时间为15.340的峰即是R-AC的峰。
实施例9:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌五.co"BL21(pETDuet-;;4'丄"ox) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为8 g干细胞/L，在40°C， pH 6.0条件下，2R,3R-BD 浓度为45g/L; 180转/分钟振荡反应20小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化 液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中2R，3R-BD 禾口R-AC的含量；
反应结束时收集转化液在8(TC进行减压蒸熘，馏份进行气相色谱分析测定转化产 物中R-AC的浓度为42.0 g/L，其ee值为96.0%。
实施例10:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备R-AC
转化实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌￡. coZ/BI^KpETDuet-j^'lMox) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为5 g干细胞/L，在20。C， pH9.0条件下，2R,3R-BD 浓度为25g/L; 180转/分钟振荡反应10小时，得到含R-AC的转化液；将所得的转化 液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清液中2R,3R-BD 和R-AC的含量；
反应结束时收集转化液在8(TC进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓度为24.0 g/L，其ee值为96.2%。
实施例11:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备2S,3S-BD
拆分实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌c0//BL21(pETDuet-;^Z"0x) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为5 g干细胞/L，在20°C, pH 9.0， 180转/分钟振 荡10小时条件下，拆分浓度为15 g/L的混合重量比例为meso-BD : 2R,3R-BD : 2S,3S-BD=75.0 : 12.6 12.4的2,3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司);将 所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在 8(TC进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S,3S-BD的浓度为1.86 g/L，其ee值为99.2%。该样品的GC图谱见图5，保留时间为33.609min的峰即是 2S,3S-BD的峰。
实施例12:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备2S,3S-BD
拆分实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌co// BL21(pETDuet-ycP朋x) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为3 g干细胞/L，在30°C， pH 8.0， 180转/分钟振 荡6小时条件下，拆分浓度为10 g/L的混合重量比例为meso-BD2R,3R-BD : 2S,3S-BD=75.0 : 12.6 12,4的2,3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司);将 所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在 8(TC进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S,3S-BD的浓度为1.24 g/L，其ee值为99.90/。。
实施例13:利用实施例2 4得到的生物催化剂制备2S,3S-BD
拆分实验使所得的生物催化剂即重组大肠埃希氏菌￡. co"BL21(pETDuet-;^i:"ox) CCTCC NO: M 208259的细胞浓度为8 g干细胞/L，在40°C， pH 6.0， 180转/分钟振 荡20小时条件下，拆分浓度为20 g/L的混合重量比例为meso-BD : 2R,3R-BD : 2S，3S-BD=75.0 : 12.6 : 12.4的2,3-BD混合物(购于国药集团化学试剂有限公司)；将 所得的转化液，以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，收集转化液在 8(TC进行减压蒸馏，釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S,3S-BD的浓度为 2.46g/L，其ee值为98.2%。序歹!J 表
〈110〉山东大学
〈120〉 一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2, 3-丁二醇生产中的应用
〈141〉 2009-l-4
〈160> 2
〈210〉 1
〈211〉廳
〈212〉腿
〈213〉枯草杆菌(5sci"〃s
〈221〉 yt/jZ基因 〈222〉 (1)…(蘭)
〈400〉 1
atgaaggcagca^gatggcagatatccgtattgaacatat60
aaaMggagcgtC3犯tggtgcggcatctgcggaagtg3t120
3tctgggcggcccga,tctttattccggttg180
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atccttgt.ta1041〈210〉 2
〈211〉 1353 〈212〉腿
〈213〉短乳杆菌as"otew7h5 6reKi5)
〈221〉 /7ox基因
〈222〉 (1)…(1353)
〈400〉 2
￡Ltg￡L&eigtC￡Lcagttgttggttgt3C3C3tgccgg犯cctttgCg3tt朋60
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ctcttccaacctaactttgatcgsccattcaactacctaaacatcttagcgcaagctgct1320
caggc咖ggttgccc犯tcagtt犯cgctt朋1353
1权利要求
1.一株基因重组菌，含有2R，3R-丁二醇脱氢酶基因ydjL和NADH氧化酶基因nox；其特征在于该菌株名为大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)；菌株已于2008年12月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NOM 208259。
2. 如权利要求l所述的基因重组菌，其特征在于所述菌株含有的2R,3R-丁二醇脱 氢酶的;^Z基因序列长度为1041个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；含有的 NADH氧化酶基因的"ox基因序列长度为1353个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
3. 权利要求1或2所述的基因重组菌在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化 2R,3R-BD生产手性纯R-AC及拆分2,3-BD混合物生产手性纯2S,3S-BD中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其涉及的实施步骤如下(1) 平板培养将菌株大肠埃希氏菌co/z' BL21(pETDuet吵々'Z"ox) CCTCC NO: M 208259划线到含有质量体积比为1.5 1. 8%琼脂的并含100 pg/mL氨苄青霉素的LB 平板上，37土1。C培养12±1小时；(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5 mL的含100吗/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37士1。C摇床 振荡培养12±1小时；(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1 3%的 接种量，接种到30 mL~500 mL含有100 )ag/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 士1。C摇床振荡培养10±1小时；(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6 10%的 接种量接种到2L 10L的改良的M9液体培养基中，37士1。C培养5 20小时，加入终 浓度为1 mM的IPTG， 10 37°C诱导5 24小时，培养过程中，检测细胞的转化能力， 当细胞的转化能力达到4 26U/ml，停止发酵；其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; NaCl 10g/L， pH7.0;上述步骤(4)中所述改良的M9液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;Na2HPO4.7H20 12.8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0.5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0.011 g/L;葡萄糖4g/L;上述细胞的转化能力的测定方法是将培养的细胞悬浮于含有10 g/L的meso-BD 的200 mM的pH7.8磷酸盐缓冲液中，37°C摇床反应20分钟，以12000 rpm的转速对 反应液离心1 min，以如下测定体系测定上清液中AC的含量；上述测定体系是140 nl 0.5% w/v的肌酸，200nl5Q/。w/v溶于95。/。乙醇的a-萘酚， 200 ^ 40% w/v的氢氧化钾，200 pl上述离心所得上清；将该测定体系25°C放置15分 钟，然后利用分光光度计测定595 nm下的吸光度值；转化能力定义为每分钟催化底 物meso-BD生成1 nmol的AC的细胞量为1U;(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8,000±500转/分钟离心15分钟； 并用pH7.4、 1/15M的PBS缓冲液洗涤菌体2 3遍，然后将细胞悬起到0.85%的生理 盐水中，使细胞的终浓度为2~10g/L;将菌体置于4。C的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂，待用；(6)转化实验制备产物以浓度为2~10 g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH 5.0 10.0条件下， 转化浓度为10-60 g/L的meso-BD; 180转/分钟振荡5 30小时，得到含S-AC的转化 液；将所得的转化液，以8,000士500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物催化剂， 然后在8(TC进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中S-AC的浓度及光学 纯度；或者，以浓度为2~10 g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH 5.0 10.0条 件下，转化浓度为10-60 g/L的2R,3R-BD; 180转/分钟振荡5 30小时，得到含R-AC 的转化液；将所得的转化液，以8,000土500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物 催化剂，然后在80'C进行减压蒸馏，馏份进行气相色谱分析测定转化产物中R-AC的浓 度及光学纯度；或者，以浓度为2-10g干细胞/L的生物催化剂，在10。C 45。C， pH5.0 10.0， 180 转/分钟振荡5 30小时条件下，拆分浓度为5 30 g/L的混合重量比例为meso-BD : 2R,3R-BD : 2S,3S-BD=75.0 : 12.6 : 12.4的2,3-BD混合物；将所得的转化液，以8,000 ±500转/分离心10 15分钟，去除所加入的生物催化剂，然后在8(TC进行减压蒸馏， 釜液进行气相色谱分析测定转化产物中2S,3S-BD的浓度及光学纯度。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述诱导培养温度为10°C 30°C;诱导培养时间为10 20h。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(4)所述细胞的转化能力当达到 10 20U/ml，停止发酵。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述转化实验是以浓度为3.0 8.0g干细胞/L的生物催化剂，在20。C 40。C， pH6.0 9.0， 180转/分钟振荡6 20小时条件下对底物进行转化。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述meso-BD的浓度为10 45g/L 。
9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述2R，3R-BD的浓度为10 45 g/L 。
10. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述2,3-BD混合物的浓度为 10 20g/L。
全文摘要
本发明公开了一株含有2R，3R-丁二醇脱氢酶基因ydjL和NADH氧化酶基因nox的大肠埃希氏菌E.coli BL21(pETDuet-ydjLnox)；菌株已于2008年12月23日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NOM 208259。本发明还公开了所述的基因重组菌在催化meso-BD生产手性纯S-AC、催化2R，3R-BD生产手性纯R-AC及拆分2，3-BD混合物生产手性纯2S，3S-BD中的应用。应用本发明的重组大肠杆菌制备的手性AC浓度可达36克/升(ee值≥96％)以上；手性纯2S，3S-BD的ee值≥98％，并且实现辅因子的再生，极具工业应用前景。
文档编号C12P7/24GK101565685SQ20091001390
公开日2009年10月28日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者吕传娟, 秦加阳, 肖梓军, 平 许, 马翠卿 申请人:山东大学