S1基因和tm-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
【专利摘要】本发明公开了一种S1基因和TM?1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因和TM?1基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315?MCS?EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315?S1?TM?1?EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有S1基因和TM?1基因的重组腺病毒pBH?S1?TM?1?EGFP；本发明用于免疫鸡以预防鸡传染性支气管炎和慢性呼吸道病，将此重组腺病毒免疫鸡后，鸡的抗体水平得到显著提高，且对鸡产生有效的保护作用。
【专利说明】
S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和 应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因生物工程领域，设及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用 IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎 病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性、传染 性呼吸道疾病，是世界禽类的主要呼吸道传染性疾病之一。鸡慢性呼吸道病（Chronic respiratoiy disease,C畑）是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepti州m,MG)感染引起的 接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降，蛋的品质降低，饲料转化率降 低，常给养鸡业带来巨大的经济损失。目前市场上的疫苗W弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们 在一定程度上可W预防和控制上述两种疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗 同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足;此外，二联苗还可W减少对动物免疫 接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方 法及重组腺病毒和应用，将IBV的主要的免疫保护性基因（S1基因）和MG的膜外蛋白基因 (TM-1基因）与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上 述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，通过免疫攻毒保护 试验检测其免疫保护效果，评价研制的预防IB和CRD的二联基因工程活载体疫苗。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种S1基因和TM-1基因重组 腺病毒的构建方法，包括W下步骤：
[0005] 1)从IBV册2株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序 列GI:S65869.1;
[0006] 所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：WSl-F沈Q ID NO.巧日S1-R沈Q ID N0.2 为引物，WIBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；WTM-1-F沈Q ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4为引物，WMG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；
[0007] 2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒PDC315-MCS-EGFP上，获 得重组穿梭质粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP;
[000引 3)将重组穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒地HGlox(delta化1， 3Cre共转染肥K293细胞，重组并包装获得重组腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0009] 所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。
[0010] 所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预 防IB和CRD中的应用。
[0011]本发明的有益效果是:分别将IBV和MG的免疫保护性基因 SI基因和TM-1基因与腺 病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺 病毒地H-S1-TM-1-EGFP，籍此研制同时预防IB和CRD两种传染病的二联基因工程活载体疫 苗。通过对免疫鸡的两种抗体水平检测和免疫攻毒试验，评价了重组腺病毒的免疫效果。研 究结果表明，免疫重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的维鸡，21日龄后两种抗体均可达到有效 抗体水平(〇〇4〇5>0.49)，且可产生与市场弱毒疫苗的免疫保护作用相当，甚至更优。本发明 研制出一种预防IB和CRD的二联基因工程活载体疫苗。
【附图说明】
[001^ 图1是S1基因 RT-PCR/PCR扩增结果(M:DL2502 DNA分子质量标准；1:S1基因 RT-PCR 产物；2: pMD-Sl质粒PCR产物）。
[001引图2是TM-1基因 PCR扩增结果(M:DL2003 DNA分子质量标准；基因 PCR产物； 2: pMD-TM-1 质粒PCR产物）。
[0014] 图3是PDC315-S1-TM-1-EGFP质粒双酶切结果（M:DL2502 DNA分子质量标准；1: pDC3i日-S1-TM-1-EGFP经EcoR I和Nhe I的双酶切产物；2:pDC3i日-S1-TM-1-EGFP经Sal I和 Xmal I的双酶切产物）。
[0015] 图4是腺病毒在肥K293细胞中的重组与包装(A:正常肥K293细胞图；B:正常肥K293 细胞巧光显微镜下图；C:转染HEK293细胞后C阳图；D:转染HEK293后C阳巧光图）。
[0016] 图5是重组腺病毒感染肥K293细胞（X 100) (A:正常肥K293细胞图；B:巧光显微镜 下正常肥K293细胞图；C:重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP感染肥K293细胞图；D:重组腺病毒 地H-S1-TM-1-EGFP感染肥K293细胞巧光图）。
[0017] 图6是重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的S1基因的PCR扩增结果(M:DL2502 DNA分子 质量标准；1:別基因 RT-PCR产物）。
[0018] 图7是重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的TM-1基因的PCR扩增结果(M:DL2003 DNA分 子质量标准；1: TM-1基因 RT-PCR产物）。
[0019] 图8是Western Blot检测在重组腺病毒感染肥K293细胞后S1蛋白和TM-1蛋白的表 达情况。
[0020] 图9是化ISA检测鸡免疫IB疫苗后的抗体水平情况。从14日龄开始，免疫pBH-Sl- TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极 显著；自28日龄开始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与IBV弱毒疫苗免疫的鸡抗体水 平差异极显著。
[0021] 图10是化ISA检测鸡免疫MG疫苗后的抗体水平情况。从14日龄开始，免疫pBH-Sl- TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫地H-EGFP的对照组鸡抗体水平显著性差 异；自从21日龄开始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH- EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著;免疫P册-S1-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与MG弱毒疫苗 免疫的鸡抗体水平始终无显著性差异。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0023] 鸡传染性支气管炎（IB)和鸡慢性呼吸道病(CRD)是严重威胁养鸡业的鸡的重要的 呼吸道传染病。目前市场上的疫苗W弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可W预 防和控制上述疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗 的优势，又能克服二者不足;此外，二联苗还可W减少对动物免疫接种时的应激并节约成 本，达到一苗多防的目的。腺病毒载体相比其他载体具有明显的优势，国内外均有很多W腺 病毒为载体制备疫苗的报道，目前腺病毒载体系统已经相当成熟。对IBV和MG的研究也已相 当清晰，有报道利用其它活载体研制IB或CRD的基因工程疫苗，且免疫攻毒试验证实对鸡有 一定的保护作用，因此，本发明利用鸡传染性支气管炎病毒的S1基因和鸡毒支原体TM-1基 因构建重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP，籍此研制预防IB和CRD两种传染病的二联基因工程 活载体疫苗。
[0024] 本发明S1基因和鸡MG TM-1基因构建重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP的方法，包括 W下步骤：
[0025] 1)IBV S1和MG TM-1基因片段的扩增与T-A克隆；
[0026] 2)构建重组穿梭质粒 PDC315-TM-1-S1-GFP;
[0027] 3)在肥K293细胞中重组和包装病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0028] 具体包括步骤如下：
[0029] 1)从IBV册2株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序 列GI:S65869.1;
[0030] 所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：WSl-F沈Q ID NO.巧日S1-R沈Q ID N0.2 为引物，WIBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；WTM-1-F沈Q ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4为引物，WMG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；
[0031] 2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒PDC31日-MCS-EGFP上，获 得重组穿梭质粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP;
[0032] 3)将重组穿梭质粒PDC31日-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒地HGlox(delta化1， 3Cre共转染肥K293细胞，重组并包装获得重组腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP。
[0033] 如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。
[0034] 如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在 预防IB和CRD中的应用。
[0035] 也就是说:分别从IBV册2株和MG S6株中扩增出目的基因；将目的基因经T-A克隆 至PMD19-T载体上;经酶切及测序鉴定后与穿梭载体PDC315-MCS-EGFP连接;利用脂质体转染 法将重组腺病毒穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架地HGlox(del化化1，3Cre共 转染肥K293细胞，经PCR、Western blot鉴定重组腺病毒;重组腺病毒纯化后，经TCID50方法 测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒和市场弱毒疫苗分别免疫鸡，ELISA检测免疫鸡抗 体，免疫攻毒检测免疫鸡的发病率和死亡率，评价研制二联疫苗免疫鸡的效果。
[0036] 下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
[0037] 1材料与方法
[003引 1.1 S1基因和TM-1基因的扩增
[0039]接种IBV册2株于9日龄鸡胚，收集的鸡胚尿囊液，利用化izol法提取病毒RNA。根 据GenBank中IBV册2的S1基因序列化U817497.1)设计引物，进行RT-PCR扩增目的基因片 段。收集接种到PPLO液体培养基中的MG S6株菌体，利用饱和酪-氯仿抽提法提取MG DM;根 据GenBank中MG TM-1基因序列（S65869.1)设计引物，进行PCR扩增目的片段。別基因引物和 TM-1基因引物见表1(划线部分为酶切位点，斜体部分为Kozak序列，加粗部分为6X化s)，Sl 基因的PCR反应体系见表2，TM-1基因的PCR反应体系见表3。
[0040] 表1扩增S1和TM-1基因片段的引物序列
[0041]
[0044] 注：反应程序为：94°C，预变性5min; {94°C，变性30s ; 62°C，退火40s ; 72°C，延伸 Imin}共32个循环，72°C延伸lOmin。
[0045] 表3 TM-1基因 PCR反应体系
[0046]
[004引注：反应程序为：94°C，预变性5min; {94°C，变性30s ; 55 °C，退火35s ; 72°C，延伸 Imin}共30个循环，72°C延伸lOmin。
[0049] 1.2重组穿梭腺病毒载体的构建
[0050] 将获得的S1基因和TM-1基因先后与穿梭载体PDC315-MCS-EGFP用相应的酶进行双 酶切(酶切反应体系见表5、表6)，再将其用T4连接酶16 °C连接12h (反应体系见表7)。经菌液 PCR、酶切及测序鉴定，筛选出正确的重组穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP。
[0051 ] 表5酶切反应体系
[0化2]
[0055]表7 T4连接酶连接体系
[0化6]
[0化引1.3腺病毒的重组与包装
[0059] 取脂质体12.0化，并将其与化g腺病毒穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP和化g腺病毒 大骨架质粒地HGlox(delta化1，3化e混匀，共转染肥K293细胞，使其在肥K293细胞中重组与 包装14d左右，收集CPE细胞，反复冻融并收集病毒，冻存-80°C。
[0060] 将收集的重组腺病毒接种到正常的肥K293细胞，观察细胞病变情况及巧光显微镜 观察细胞巧光情况。通过提取病毒基因组试剂盒提取重组腺病毒的DNA，并进行PCR检测目 的基因；收集重组腺病毒感染4她后的皿K293细胞，然后通过western blot检测S1蛋白和 TM-1蛋白的表达情况。
[0061 ] 1.4重组腺病毒滴度的测定
[0062] 利用腺病毒纯化试剂盒，将重组腺病毒纯化，再根据TCIDso法检测重组腺病毒的滴 度。
[0063] 1.5 ELISA检测免疫鸡的抗体水平
[0064] 选取SPF鸡120只，随机分组6组，20只/组;分别设置地H-S1-TM-1-EGFP(a)组、P册- Sl-TM-1-EGFP(b)组、IB弱毒疫苗组、MG弱毒疫苗组、pBH-EGFP(对照1)组和地H-EGFP(对照 2)组。7日龄进行首免，2旧龄二免，点眼免疫接种106TCID5〇/mL，期间，每7天进行一次翅下 静脉采集血并分离血清。利用化ISA试剂盒检测免疫鸡不同时间的抗体水平。
[00化]1.6免疫保护试验
[0066] 分别对pBH-Sl-TM-1-EGFP(a)组、IB弱毒疫苗组、pBH-EGFP(对照1)组进行接种强 毒IBV;分别对pBH-Sl-TM-1-EGFP(b)组、MG弱毒疫苗组、地H-EGFP(对照2)组进行接种强毒 MG;统计鸡的发病率与死亡率。
[0067] 2结果与分析
[006引 2.1 S1基因和TM-1基因的RT-PCR与PCR扩增结果
[0069] 利用根据GenBank中S1基因序列设计的S1基因引物对提取IBV的RNA进行RT-PCR扩 增，经测序，获得大小为1650bp左右的预期片段;T-A克隆获得PMD-S1质粒，同样利用设计的 S1基因引物进行PCR扩增，经测序，获得大小为1650bp左右的预期目的片段(见图1)。
[0070] 利用根据GenBank中TM-1基因序列设计的TM-1基因引物对提取MG的DNA进行PCR扩 增，经测序，获得大小为804bp左右的预期片段;T-A克隆获得PMD-TM-1质粒，同样利用设计 的TM-1基因引物进行PCR扩增，经测序，获得大小为804bp左右的预期目的片段(见图2)。
[0071] 2.2扩增的SI基因与TM-1基因测序结果分析
[0072] 将测序后的S1基因和TM-1基因的核巧酸序列分别与GenBank中S1基因核巧酸序列 化U817497.1)和TM-1基因核巧酸序列（S65869.1)进行Blast对比分析，S1基因序列的同源 性达98%，TM-1基因序列的同源性达100%，且均无碱基缺失和插入。
[0073] 2.3腺病毒重组穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP双酶切结果
[0074] 利用设计的限制性内切酶EcoR巧日Nhe I对腺病毒重组穿梭质粒PDC315-S1-TM-1- EGFP进行双酶切鉴定，经测序，获得大小为1650bp左右的预期片段；同样，利用设计的限制 性内切酶Sal I和Xmal I对腺病毒重组穿梭质粒PDC315-S1-TM-1-EGFP进行双酶切鉴定，经 测序，获得大小为804bp左右的预期片段(见图3)。
[0075] 2.4腺病毒骨架和穿梭质粒共转染HEK293细胞结果
[0076] 利用脂质体将腺病毒大骨架分别与重组穿梭质粒共转染皿K293细胞，经过14d左 右培养后，对皿K293细胞进行观察，细胞逐渐出现肿大、变圆，呈葡萄串状，脱离细胞培养皿 等细胞病变，在巧光显微镜下经过蓝光激发，可看到细胞呈现绿色巧光，证明分别包装出重 组腺病毒地H-S1-TM-1-EGFP(见图4)。
[0077] 2.5包装完成的重组腺病毒感染HEK293细胞结果
[0078] 将包装完成的原代(Po代）重组腺病毒分别感染正常皿K293细胞，出现细胞肿大、 变圆，呈葡萄串状，脱离细胞培养皿等细胞病变，在巧光显微镜下通过蓝光激发，可看到细 胞呈现绿色巧光;未感染细胞状态正常，且在巧光显微镜下观察不到细胞及绿色巧光(见图 5)。
[00巧]2.3重组病毒的目的基因检测
[0080] 对包装好的重组腺病毒提取DNA，分别利用设计的S1基因和TM-1基因引物进行PCR 扩增，并对目的基因序列进行测序分析，结果显示：分别在1650bp左右和804bp左右处出现 与预期片段大小一致的目的条带(见图6、图7)。
[0081 ] 2.6 Western blot检测S1蛋白和TM-1蛋白表达的结果
[0082] Western Blot结果显示：重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP在约90邸a处出现特异性 条带，与预期S1蛋白分子质量大小相当；pBH-Sl-TM-1-EGFP在约29KDa处出现特异性条带， 与预期TM-1蛋白分子质量大小相当；pBH-Sl-TM-1-EGFP和pBH-EGFP在约43邸a处均出现特 异性条带，与预期内参β-actin蛋白分子质量大小相当（见图8)。
[0083] 2.7重组病毒的滴度测定结果
[0084] 对纯化浓缩后的重组腺病毒作倍比稀释后感染肥K293细胞，感染7d后，根据KaBer 法进行计算阳性孔比率，现憶其滴度为1〇w'875TCID5〇/血。
[0085] 2.8 ELISA检测结果
[0086] 根据化ISA试剂盒说明书，利用分离的血清检测其抗体OD405。
[0087] 从14日龄开始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫 pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著；自28日龄开始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP的鸡抗 体水平与IBV弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平差异极显著。（见图9)。
[0088] 从14日龄开始，免疫pBH-Sl-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫 pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平有显著性差异；自从21日龄开始，免疫地H-S1-TM-1-EGFP和 MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫地H-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著;免疫pBH- Sl-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与MG弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平始终无显著性差异(图10)。
[0089] 从21日龄开始两种抗体均可达到有效抗体水平(0D>0.49)(见图9、图10)。
[0090] 2.9免疫保护结果
[0091] 攻毒试验结果显示：IBV强毒攻毒后，pBH-Sl-TM-1-EGFP免疫组保护率为90%，弱 毒IBV疫苗组保护率为85% (见表8);强毒MG攻毒后，pBH-Sl-TM-1-EGFP免疫组保护率为 80%，弱毒MG疫苗组保护率为85% (见表9)。
[0092] 表8强毒IBV攻毒鸡的免疫保护结果
[0093]
[0096] 3 结论
[0097] 3.1从IBV册2株和MG S6株中分别扩增出S1基因和TM-1基因，并分别成功连接到 PMD19-T载体上，分别获得pMD-別和pMD-TM-1克隆质粒。
[009引 3.2成功获得重组穿梭质粒口0〔315-51-了1-1斗6尸口。
[0099] 3.3成功获得重组腺病毒98护51-了1-1斗6。？;且重组腺病毒能够很好的表达51蛋 白和TM-1蛋白。
[0100] 3.4收获的重组腺病毒98护51-了1-1斗6。?滴度为：10心8呵(：1050/1^，符合后续动 物试验的所需的滴度要求。
[0101] 3.5构建的重组腺病毒免疫鸡的抗体水平及免疫效果与弱毒疫苗相当，甚至更优。
[0102] 本发明的创新之处在于，首次将IBV的主要的免疫保护性基因（S1基因）和MG的膜 外蛋白基因（TM-1基因）与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出 能够表达上述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，并通过 免疫攻毒保护试验检测了其免疫保护效果，成功研制了预防IB和CRD的二联基因工程活载 体疫苗。
[0103] W上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内 的技术人员能够理解本发明的内容并据W实施，不能仅W本实施例来限定本发明的专利范 围，即凡本发明所掲示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
【主权项】
1. 一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI:EU817497.1和TM-1基因序列 GI：S65869.1； 所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：以S1-FSEQIDN0.1和S1-RSEQIDN0.2为引 物，以IBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1 基因；以TM-1-F SEQ ID N0.3和TM-1-R SEQ ID NO. 4为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因； 2) 分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重 组穿梭质粒 pDC315-Sl-TM-1-EGFP; 3) 将重组穿梭质粒pDC315-Sl-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox El，3Cre共转染 HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-Sl-TM-1-EGFP。2. 如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。3. 如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在 预防鸡传染性支气管炎和鸡慢性呼吸道病中的应用。
【文档编号】A61K39/215GK106011087SQ201610622267
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】金天明, 张东超, 弓建芳, 高珂珂, 李小慧, 林静, 孟佳丽, 尚翠玲, 李昕
【申请人】天津农学院