一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得的禽流感病毒，包括以下步骤：1)制备待接种的MDCK细胞；2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；3)F1代病毒驯化：4)F2代病毒驯化：取F1代中禽流感病毒血凝效价最高的时间点所留取的上清液样本，重复步骤3)；5)F3代病毒驯化：培养F3代病毒的温度为35℃；6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)，得到驯化完成的禽流感病毒；本发明的驯化方法将禽流感病毒从使用鸡胚培养直接驯化到完全适应在无血清悬浮培养的MDCK细胞上高效繁殖，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定。
【专利说明】
-种在无血清全悬浮培养的MDCK细胞生长的禽流感病毒的制 备方法及获得的禽流感病毒
技术领域
[0001] 本发明设及病毒培养驯化领域，具体设及一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细 胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得的禽流感病毒。
【背景技术】
[0002] 我国目前生产的H9亚型禽流感灭活疫苗都采用鸡胚作为病毒生长载体，疫苗成本 偏高，且没办法应对急性大规模的禽流感流行。目前已有少数厂家采用贴壁MDCK细胞培养 方法制备H5禽流感疫苗，然而，在单细胞层培养体系中，细胞的增殖受到基质表面积的限 审IJ，很难实现大规模培养，消化过程也增加了工艺的复杂性、生产时间和成本。无血清悬浮 培养可W突破细胞生长表面的限制，无需昂贵的微载体和添加血清，还可W节约设备空间， 提高设备的利用率，便于扩大生产规模。另外，因生产过程中无需微载体和消化液，从而可 大大减少产品杂质的引入，简化产品的后期分离纯化过程，有效降低生产成本。故而，将鸡 胚培养的禽流感病毒驯化为适应在无血清悬浮培养MDCK细胞上高效繁殖，对于提高禽流感 病毒的生产效率，并且对于禽流感疫苗的生产，皆具有重大意义。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种适应在无血清全悬浮培养 的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，本发明的驯化到适应在无血清悬浮培养 MDCK细胞上高效繁殖，完全摆脱了对鸡胚的依赖，也摆脱了贴壁细胞培养规模的限制，驯化 效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种适应在无血清全悬浮培养的 MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，包括W下步骤：
[0005] 1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞:将MDCK细胞装入摇瓶，在转 速13化pm，溫度37°C、通入浓度为5%的C〇2的条件下，置于培养箱中培养;然后每12h取样一 次，进行细胞计数;在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞 密度为0.5 X 106ce 11 s/mL，并W此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待 接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；
[0006] 2)准备毒种:准备鸡胚源禽流感病毒；
[0007] 3)F1代病毒驯化:按培养基体积的1%。接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种 于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶进行培养;每1化检测 病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h;培养F1代病毒的溫 度为37°C;
[000引4)F2代病毒驯化:取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本;培养F2代病毒的溫度为 37。。
[0009] 5)F3代病毒驯化:取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本;培养F3代病毒的溫度为35 。。
[0010] 6)F4~F10代病毒驯化:重复步骤5)的过程培养F4~F10代，得到驯化完成的禽流 感病毒。
[0011] 作为本发明的一种优选的方案：步骤1)中，所述装入摇瓶并置于培养箱中培养的 MDCK细胞为通过无血清培养基从MDCK贴壁细胞驯化为全悬浮培养的MDCK细胞。
[0012] 作为本发明的一种优选的方案:所述全悬浮培养的MDCK细胞通过W下步骤得到：
[0013] I)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80~90%时，弃 去培养MDCK细胞的培养基，用膜酶溶液清洗细胞层后弃去溶液;再次加入膜酶溶液至覆盖 MDCK细胞进行消化5~15min;待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化;然后收集 细胞悬液，并将细胞悬液离屯、后弃上清，获得细胞团；
[0014] Π)将步骤I)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，获得细胞重悬液；
[0015] 虹）将步骤Π )中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30巧m、溫度37°C、5%C02的 条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转 速提升至12化pm;每隔4她用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3~ 1.6X 106cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。
[0016] 作为本发明的一种优选的方案:所述无血清培养基按浓度计，包括W下组分：
[0017] 基础代谢营养物： D-葡萄糖 3000 ~ lOOOOmg/。 丙禍酸飾 50~600mg/L; L巧氨酸 5~30mg/U 以精氣酸 150~撕0妨龄14 心天冬醜胺 10~60mg/L; ^天冬氨酸 10~60mg/L; 心脫氨酸 10 ~ 80m呂心
[001引心半化氨酸 20~150mgA-,; 以谷氨酸 5~60mg/1L; L-谷氨醜胺 300~1500mg/L; 甘氨酸 10~lO&ag/L; L纽氨酸 10~ 150mg/L; 心异亮氨酸 20~ 150mg人L; L亮氨酸 50 ~250mg,a_,; 以赖氨酸 50~150mgAL; 心甲硫氨酸 20-' 150mg/L; L-苯巧氨酸 20 ~ 250mg/k L-脯氨酸 20~200mg/：L; L丝氨駿 訊~15化鸣八-；
[0019] 以蘇.氨酸 沸-鄉Qrag化； 心色氨酸 20~i00mg/L; L酷氨酸 20~!00mg/k L鎖氨酸 沸~200mg/L;
[0020] 核巧酸： 次黄噪冷 2~25mg,l; 胸普 0.1 ~lmg./L;: 腺普 2叫51哨知一；
[0021] 尿普 2~15mg/^ 月包普 2~ 15mg/L; 鸟普 2~i5mg/U
[0022] 维生素： D-生物素 0.01 ~0.20mg/L; 叶酸 1 ~ lOmg/L; 烟醜胺 l~10mg/L; 化唉醇 X~lOmg/k
[0023] 疏胺素 l~10mg心 核黄素 0.1 ~ Img心 氯化胆碱 10 ~ 50mg/L; D-泛酸钩 2~lOmg/L;
[0024] 肌醇 10. - 5()mg,心
[0025]无机盐： 石肖酸铁 I0~50mg/L; 碗酸亚铁 0.1 Img/L; 硫酸緩 20~100 mg/L; 氯化卸 200~500mg/L;
[0026] 氯化納 5000 ~ 900〇11巧尼； 鱗酸氨二铜 50~lOOmg/L; 鱗酸二氨納 50 ~ lOOmg/L; 亚爾酸納 20 ~ l.〇0rng/b
[0027] 剪切力保护剂： 500~2500mg/l;
[002引抗细胞结团剂： 20~150mg/l;
[0029]酸碱度缓冲剂：
[0030] 碳酸氨钢 1000 ~3000mg/l;
[0031] 酸碱度指示剂：
[0032] 酪红 5~15mg/l;
[0033] 流感病毒增殖促进剂： 胆固醇 r~10mg/L; DL-货-生育醋·醋酸醋 0 J~3mg/L; 豆寇酸 0.05 ~ 0.5〇巧化；
[0034] 標桐酸 0.05 …0.5mg/L; 硬脂酸 0.05 ~ 0.5mg/L; 氯化緩 1000~5000mg/L: 氯化妈 50250mgzL; 二甲基亚麟 2 ~ 20mg/L; 硫酸辞 0.2 ~ 2.0mg/L;
[003引硫酸铜 5 ~ 25mg/L; 硫酸短 0.0001~化001 mg/L， 偏轨酸锭 0.001~0.005m呂化；
[0036] 其它添加物： 梓橡酸铁镇 B.5 ~ 40.5mg化； 腹爲素 2~15mg/L;
[0037] 大豆水解物 1000 ~ 5000nig/L; 乙醇胺 1~]0〇巧,心； 谷脱甘化 0.5~3mg化。
[0038] 作为本发明的一种优选的方案:所述剪切力保护剂为嵌段式聚酸F68。
[0039] 作为本发明的一种优选的方案:所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。
[0040] 作为本发明的一种优选的方案:将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~ 30°C溶剂中溶解，得到混合液;调节混合液的抑至6.3~6.7,定容后得到无血清培养基。
[0041] 作为本发明的一种优选的方案:所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
[0042] 作为本发明的一种优选的方案:所述步骤2)中，鸡胚源禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 IDso/O.l 血。
[0043] 本发明的另一个目的在于提供一种禽流感病毒，该禽流感病毒可在MDCK细胞中 高效感染复制，病毒特性稳定，病毒含量和HA血凝效价皆有所提高。
[0044] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:通过上述的制备方法获得。
[0045] 本发明的有益效果在于：
[0046] 1、本发明的驯化方法将禽流感病毒从使用鸡胚培养直接驯化到完全适应在无血 清悬浮培养的MDCK细胞上高效繁殖，无需经历贴壁细胞过程，完全摆脱了对鸡胚的依赖，也 摆脱了贴壁细胞培养规模的限制，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制， 病毒特性稳定；
[0047] 2、本发明所使用的无血清培养基不含动物血清、成本低;支持MDCK单细胞高密度 全悬浮培养并可同时用于禽流感病毒的细胞培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；
[0048] 3、本发明将需血清贴壁培养的MDCK贴壁细胞驯化为适应无血清全悬浮培养的 MDCK细胞，驯化时间短，获得的全悬浮培养的MDCK细胞形态饱满，大小均一，活性大，有利于 禽流感病毒的接种和培养；
[0049] 4、通过驯化方法获得的禽流感病毒在全悬浮培养MDCK细胞中可高效感染复制，病 毒特性稳定，病毒含量和HA血凝效价皆有所提高，获得的禽流感病毒适用于生物反应器培 养并制备禽流感疫苗半成品。
【附图说明】
[0050] 图1为实施例4中贴壁状态下MDCK细胞形态图；
[0051 ]图2为实施例4中经本发明无血清培养基驯化下的MDCK细胞形态图；
[0化2] 图3为实施例4中采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法 得到的悬浮培养的MDCKS细胞形态图；
[0053] 图4为实施例4中采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMI F8间接法驯化得到 的MDCK.SUS2细胞形态图；
[0054] 图5为实施例5中活细胞密度和细胞活性曲线图。
【具体实施方式】
[0055] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0化6] -、制备无血清培养基：
[0057]所述无血清培养基按浓度计，包括W下组分：
[005引基础代谢营养物： D-葡萄糖 3000 ~1 OOOOmg/l.; 巧綱酸锅 50 ~ 600mg/L; 心巧氨酸 5~30mg,'1L; 心精氨酸 150 -- 600mg/1L; 心天冬醜胺 10 ~ 60mg/L; 心天冬氨酸 10~60mg^;
[0059] L脱氨酸 10 ~80mg/l.; 以半脱氨酸 2D ~ 150mg/L; 心谷氨酸 5~60mg,'1L; ：L-谷氨醜胺 300 - 1500mg/L; 甘氨酸 10~lOOmg/L.; L纯氨酸 10~150mg/T; L-异亮氨酸 20 ~ 150mg/L; L亮氨酸 50~250mg/。 L-赖氨酸 50~ 150mg,l; 心甲硫氨酸 細~150mg/L; 心苯巧氨酸 20~250mg/。 L-脯氨酸 20~200mg,l;
[0060] B 9 L丝風酸 沸~150mg/L; 心苏氨酸 彿~200mg/。 L-色氨酸 鄉~ lOOmg'l; 心酪氨酸 細~100mg/L; 心额氨酸 彿~200mg/。
[0061] 核巧酸： 次黄噪。令 2~25mg^; 胸苦 D.1'-Img/U 腺普 2 ~ 15mg/L;
[0062] " _ 口 尿甘· 2 ~ 15mg/L; 月包普 2 ~ 15mg/L; 鸟茸 2'-15mg/L;
[00创维生素： D-生物素 化01~化20mg/^ 叶酸 1 ~ lOmg/L; 烟醜胺 1 ~ lOmg化； 中乙唉醇 1~10111呂化；
[0064] 硫按素 1 ~lOmg'l; 核黄素 0.1~lmg/L; 氯化胆碱 10 ~ 50mg/L; D-泛酸钩 2~ 10mg,l; 肌醇 10 ~ 50mg化；
[0065] 无机盐： 硝酸铁 10~50mg/T.; 碗酸亚铁 0.1 ~ Img/L:
[0066] ,, 硫酸锭 20~lOOmg/1一； 氯化钟 200 ~ 500mg/L; 氯化钥 5000 ~ 9000mgZ^ 鱗酸氨二納 50 ~ lOOmg/L;
[0067] 鱗酸二氨铜 50-- lOOrngA-.; 亚巧酸销 20 ~ lOOmg/L;
[0068] 剪切力保护剂：
[0069] 嵌段式聚酸 F68 500 ~2500mg/l;
[0070] 抗细胞结团剂：
[0071] 硫酸葡聚糖 20~150mg/l;
[0072] 酸碱度缓冲剂：
[0073] 碳酸氨钢 1000 ~3000mg/l;
[0074] 酸碱度指示剂：
[0075] 酷红 5 ~15mg/X;
[0076] 流感病毒增殖促进剂： 胆固醇 1~lOmgZU D^a-生育酪醋酸醋 0.3~3mg/L; 豆寇酸 0.05~0.5mg/l：一； 掠桐酸 0.05 ~ 0.5mg/L; 硬脂釀 0.05 ~ 0.5mg/L; 氯化娱 ！000~500加 '巧心；
[0077],. 氯化钓 50.-25〇111呂心 二甲基亚观 2~20mg心 碗酸辞 0.2 ~ 2.0mg/L; 硫酸铜 5 ~ 25mg/L; 硫酸短 0.0001~化001 mg/b 偏轨酸锭 0.001 ~ 0.005mg.,l;
[007引其它添加物： 持橡酸铁锭 13.5~40.5mg/L; 跋岛素 2~ 15mg/^
[0079] 一 欠豆水解物 1000 '- 5000nig/L; 乙醇胺 1~]0m呂心
[0080] 谷脱甘肤 0J~3mg/L。
[0081] 其中，核巧酸中选用次黄嚷岭和胸巧，能促进MDCK细胞的核巧酸合成，保证细胞的 生长;次黄嚷岭和胸巧成分太高，会抑制细胞生长；
[0082] 其中，其他添加物中选用巧樣酸铁锭，用W替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响 细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产 的不确定性和不安全性;巧樣酸铁锭依靠二价金属离子通道DMT1吸收铁，转铁蛋白通过转 铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了 MDCK细胞对铁的吸收速率;巧樣酸铁锭成分浓度过 高会抑制MDCK细胞生长;浓度太低，MDCK细胞对铁的吸收不足；
[0083] 其中，其它添加物中膜岛素的浓度在2~15mg/L，能促进葡萄糖代谢，保证MDCK细 胞的生长和维持MDCK细胞的活性；
[0084] 其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在1000~5000mg/mL，能保证维生素、金属 离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高MDCK细胞对氨基酸的摄取；
[0085] 将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~30°C溶剂中溶解，得到混合液;调 节混合液的pH至6.3~6.7，定容后得到无血清培养基。
[0086] 二、制备全悬浮培养的MDCK细胞：
[0087] I)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80~90%时，弃 去培养MDCK细胞的培养基，用膜酶溶液清洗细胞层后弃去溶液;再次加入膜酶溶液至覆盖 MDCK细胞进行消化5~15min;待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化;然后收集 细胞悬液，并将细胞悬液离屯、后弃上清，获得细胞团；
[0088] Π)将步骤I)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，获得细胞重悬液；
[0089] 虹）将步骤Π )中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30巧m、溫度37 °C、5 % C〇2的 条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转 速提升至12化pm;每隔4她用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3~ 1.6X 106cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。
[0090] Ξ、一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法， 包括W下步骤：
[0091] 1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞:将MDCK细胞装入摇瓶，在转 速13化pm，溫度37°C、通入浓度为5%的C〇2的条件下，置于培养箱中培养;然后每12h取样一 次，进行细胞计数;在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞 密度为0.5 X 106ce 11 s/mL，并W此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待 接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；
[0092] 2)准备毒种：准备鸡胚源H9N2亚型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 ID 日 o/O.l血；
[0093] 3)F1代病毒驯化:按培养基体积的1%。接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种 于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶进行培养;每1化检测 病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h;培养F1代病毒的溫 度为37°C;
[0094] 4)F2代病毒驯化:取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本;培养F2代病毒的溫度为37 V;
[00M] 5)F3代病毒驯化:取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本;培养F3代病毒的溫度为35 。。
[0096] 6)F4~F10代病毒驯化:重复步骤5)的过程培养F4~F10代，得到驯化完成的禽流 感病毒。
[0097] 具体实施例
[0098] 实施例1-3用于说明无血清培养基的效果：
[0099] 实施例1
[0100] 所述无血清培养基按浓度计，包括W下组分：
[0101] 基础代谢营养物： D-葡萄糖 4500mg/^ 巧醜酸铜 220mg/L; L-巧氨酸 22.3mg/L; 以精氨酸 273.9mg.AL; 心天冬醜胺 33.9mg,l; 以天冬氨酸 33.31雌心 心脱氨酸 42.67mg/L; 心半脱氣酸 （)8.60mg/l：一； L谷氨酸 36.8mg/。 以谷氨醜胺 876mg/L; 甘氨酸 26.44mg化；
[0102] L-组氨酸 73.50mg/L; ^异亮氣酸 89.52mg/^ L 亮氨酸 15乂％mgA-; 以赖氨酸 107.21 mg/b L-甲硫氨酸 87.74mg/L; 心苯巧氨酸 100.38mg化; L-脯戴酸 96.47巧各凡； L-丝氨酸 78.46mg/L; L-苏氨酸 B6.46mg/L; 心色氨酸 57.8 L-酪氛駿 56.87mg/L; 心鐵戴酸 96.85mg/L;
[0103] 核巧酸： 次黄噪吟 K).3mg/L·; 胸普 0.24mg/L; 腺普 7mg化；
[0104] ， 藏普 7rag/L; 胞普 7mg/L; 鸟普 7mg/：L;
[010引维生素： D-生物素 0.0720巧,心 叶酸 5.32m:g/L; 烟醜胺 3.14mg/L; 化巧醇 3.15mg/^
[0106] 硫胺素 3.23mg/b 核黄素 0.36mg/L; 氯化胆碱 26.01nig/l; D-泛酸钩 5.82mg/l; 肌奪 25地曼化；
[0107] 无机盐： 硝酸铁 24.19mg^; 硫酸亚铁 0.417mgAL; 硫酸矮 48.8mg/：L;
[010 引 氣化钟 311.8mg/^ 氯化纳 6860mg/1L; 禱酸氨二铜 71mg/L; 麟酸二氨铜 62.5mg化；
[0109] 亚願酸納 51.881唯化；
[0110] 剪切力保护剂：
[0111] 嵌段式聚酸 F68 1600mg/l;
[0112] 抗细胞结团剂：
[0113] 硫酸葡聚糖 50mg/l;
[0114] 酸碱度缓冲剂：
[0115] 碳酸氨钢 2200mg/l;
[0116] 酸碱度指示剂：
[0117] 酪红 8mg/l;
[0118] 流感病毒增殖促进剂： 胆圏零 3.13mg/1L; DLa-生育酿酷酸醋 1.39mg/L; 豆寇酸 0.2284mg/L; 掠桐酸 0.2嫌脚摸'L; 硬腊酸 0.285mg化； 氯化矮 2的6rng/l：;
[0119] 氯化妈 174.9mg/L; 二甲基亚碼 1 ling/L, 硫酸辞 OJmg/L; 碗酸铜 15.97mg/L; '硫酸短 0.000302mg/。 偏饥酸镇 0.00234mg/L;
[0120] 其它添加物： 掉橡酸铁锭 巧放g/L; 化岛素 6.94口巧化；
[0121] 大互水解物 21 OOmg^; 乙醇胺 3.46mg/L; 谷脱甘肤 1.4mg/L。
[0122] 将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~3〇°C溶剂中溶解，得到混合液;调 节混合液的抑至6.5，定容后得到无血清培养基。
[0123] 实施例2
[0124] 所述无血清培养基按浓度计，包括W下组分：
[01巧]基础代谢营养物： D-葡萄糖 3715mg.AL; 丙禍酸辆 llOmg/L; ^丙-氣酸 11.2.11巧几； L精氨酿 21乂11雌八一； 心天冬醜胺 22.6mg/l; 心天冬氨酸 22.2mg/^
[0126] 心賊氨酸 28.45mg/lL; ^半化氨酸 54.88mg,l; L谷氨酸 18.4mg/L; 心谷氨醜胺 584mg/L; 甘氨酸 13.22mg化； 心组氨酸 36.75mg/lL; L-异亮氣酸 44.76mg/]L; 心亮氨酸 7 乂 69mgzL; L-赖氨酸 85.77mg/L; L-甲硫氨酸 43.87mg^; 心苯丙氨釀 5化19mg/L; L-脯氨酸 48.24mg/L;
[0127] L-丝氨酸 62.巧mg/L; L苏氧酸 85.29mg/L; L 色氨酸 38.54mg^; 以骼氨酸 45.50i?g化； 心鎖氨酸 58.HmgA_.;
[012引核巧酸： 次黄噪哈 5.2mg/。 胸普 化12mg/^ 腺普 3.5mg/L;
[0129] 尿普 3.5mg/L; 月包普 3.5mg/L; 鸟普 3.5;iiig/L;;
[0130] 维生素： D-生物素 0.036mg,'L; 叶酸 2.燃mg化;. 烟醜胺 1.51mg/L;
[0131] 化唉醇 1.61雌心 硫胺素 1.62mg/L; 枯黄素 ai8mg/T.; 氯化胆碱 13mg/：L;
[01 创 D-泛酸钩 2.91 mg/b 肌醇 12.5mg/L;
[0133] 无机盐： 硝酸铁 24.19mg/!：_.; 硫酸亚铁 0.4171雌心 硫酸矮 24.4mg/L; 氯化舒 311.姑塔化；
[0134] 氯化铜 5488mg/^ 蹲薇蠢二销 巧抑g/L; 麟酸二氨铜 62.5mg/L; 亚禍酸铺 25.94mg/L;
[0135] 剪切力保护剂：
[0136] 嵌段式聚酸 F68 lOOOmg/l;
[0137] 抗细胞结团剂：
[0138] 硫酸葡聚糖 25mg/l;
[0139] 酸碱度缓冲剂：
[0140] 碳酸氨钢 2200mg/l;
[0141] 酸碱度指示剂：
[0142] 酪红 8mg/l;
[0143] 流感病毒增殖促进剂： 胆国釀 1.57mg/：L;
[0144] DL-α-生育敵醋酸酶 0,7m名瓜； 豆葱酸 0.1142mg/L; 掠桐酸 0.128mg/L； 硬脂酸 （U43mg心 氯化钱 1904mg/1L; 氯化辑 n6,6mgA,;
[0145] 二甲基亚观 5.5iTig/L; 石荒酸舞 0,4mg/L; 硫酸铜 7.98mg/L; 硫酸短 0.000151 mg/L; 偏饥酸锭 0.00117mg/L;
[0146] 其它添加物： 粹橡酸铁镇 13.5mgZl·一； 跋岛素 5mg化；
[0147] 大豆水解物 1400mg/T·; 乙醇胺 1.73mg/L; 答脱甘献 0;.?mg/L。
[014引将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~30°C溶剂中溶解，得到混合液;调 节混合液的pH至6.4，定容后得到无血清培养基。
[0149] 实施例3
[0150] 所述无血清培养基按浓度计，包括W下组分：
[0151] 基础代谢营养物： D-葡萄糖 撕:00mg/'L;
[0152] 巧禍酸销 440mg/L; 心巧氨酸 22.5mg/b L-精氨酸 547.8mg/L； L-天冬耽胺 45.2mg/L; 1_.-天冬氯醜 55.5mg/L; L眺氨酸 64.0 ImgZ。 以半脱氨酸 10么始辕L; L谷氨酸 55.2mg^ 一； 心谷氨眺胺 1460mg/^ 甘氨酸 52.()8mgZ^ L组氨酸 110.25mg^; 心异亮氨酸 134.28mgC:;
[0153] 心亮氨酸 23 乂 07〇1霞,心 L-赖氨酸 134.01 mg/。 心甲硫氨酸 109.68nigZL; 心苯丙氨酸 200.76mg/L; 以脯氨酸 144.7img/L?; 心丝氨酸 117.69mg/L; 心苏氨酸 17化57mg/U: L-色氨酸 77.07mg/L; L-!骆氨酸 85.31 mg心 心鋼氨酸 145,28mg^;
[0154] 核巧酸： 次黄。票吟 20.6mg/：L;
[0155] 胸普 0.48mg,'T; 腺菩 10.5mgA-; 尿普 10.5mg/L;
[0156] 胞菩 K).5mg,''1L; 鸟苦 10.5mgAL;
[0157] 维生素： D-生物素 0.144mg/l_; 叶酸 7.98mg/U 烟晚胺 6.28mg/L; 化巧醇 6,3mg,^
[015 引硫胺素 6.46mgAL; 板黄素 0.72mg/L; 氯化胆碱 巧.02mg/：L; D-泛酸钩 8.73mg/。 肌醇 37.5mg/L;
[0159] 无机盐： 硝酸铁 24.19mgZ。 硫酸亚铁 0.417mg/L; 硫酸緩 73.2mg/L; 氯化钟 SllJmg/L;
[0160] 氯化納 的75mg^; 蹲酸氨二铜 71mg/'L; 鱗酸二氨铜 62.5mg/'I， 亚觸酸納 77.82mg化；
[0161] 剪切力保护剂：
[0162] 嵌段式聚酸 F68 2200mg/l;
[0163] 抗细胞结团剂：
[0164] 硫酸葡聚糖 lOOmg/l;
[0165] 酸碱度缓冲剂：
[0166] 碳酸氨钢 2200mg/l;
[0167] 酸碱度指示剂：
[016 引酪红 8mg/X;
[0169] 流感病毒增殖促进剂： 胆固醇 6.26mg/L; DL-a-生育盼醋酸醋 2.1 m畏/L:;: 至蘿酸 0.34化mg/b 掠桐酸 C).384mg/^ 硬脂酸 0.428mg/lL; 氯化緩 4762mgZI^;
[0170] _ 氯化妈 233.2mg/L; 二甲基亚踢i 化Jmg/L; 硫酸辞 1.6mg/L; 硫酸铜 23.96mg/L; 硫酸猛 O.WQ453mg,'L; 偏轨酸矮 0.00351 mg/L;
[0171] 其它添加物： 将橡酸铁矮 40.5mg/U 敗岛素 10.41mg/L;
[0172] 大豆水解物 4200mg,a.; 乙醇胺 5.!9mg.^;
[017引谷脱甘肤 2,lmg/L。
[0174] 将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~3〇°C溶剂中溶解，得到混合液;调 节混合液的pH至6.7，定容后得到无血清培养基。
[0175] 将实施例1-3获得的培养基培养MDCK细胞并进行特性试验：
[0176] 1、仪器:Bio-Bundle生物反应器（购自荷兰Applikon Biotechnology公司），罐体 体积为化；
[0177] 2、用于对照的MDCK细胞通过商品化无血清培养基SFM4 Mega Vir(购自Hyclone公 司)培养得到；
[017引3、培养方法：W0.5X106cells/mL的细胞密度接种细胞至生物反应器中，在37°C、 通入浓度为5 %的CO2的条件下进行批培养，每24h取样进行活细胞计数，并计算细胞生长速 率;结果如表1、表2所示：
[0179] 表1最高活细胞密度(106cells/mL)
[0180]
[0183] 与对照组商业化无血清培养基SFM4 Mega Vir悬浮培养的MDCK细胞相比，采用本 发明所提供的无血清培养基，在培养过程中支持的活细胞密度有大幅度的增长;此外，在非 指数生长期细胞的比生长速率从对照的0.57CT1最大增长到实施例1中的0.91CT1，细胞倍增 时间则从对照的〇.79d最大缩短至实施例1中的0.32d。可见采用本发明的无悬浮培养基获 得的MDCK细胞，在细胞生长速率和细胞活性均有较大的提高。
[0184] 实施例4-5说明用于禽流感病毒驯化的MDCK细胞驯化过程及细胞特性：
[01化]实施例4
[01化]一、制备无血清培养基：
[0187]采用实施例1制得的无血清培养基；
[018引二、制备全悬浮培养的MDCK细胞：
[0189] I)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80~90%时，弃 去培养MDCK细胞的培养基，用膜酶溶液清洗细胞层后弃去溶液;再次加入膜酶溶液至覆盖 MDCK细胞进行消化5~15min;待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化;然后收集 细胞悬液，并将细胞悬液离屯、后弃上清，获得细胞团；
[0190] Π )将步骤I)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，获得细胞重悬液；
[0191] 虹）将步骤Π )中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30巧m、溫度37 °C、5 % C〇2的 条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，每隔4她用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀 释至细胞密度为1.3~1.6X 106cells/mL，进行传代，获得MDCK细胞。
[0192] 通过贴壁培养和通过本实施例获得的MDCK细胞形态比较如图1-4所示：
[0193] 图1为贴壁状态下MDCK细胞贴附于培养介质表面，呈铺路石状；
[0194] 图2为本实施例悬浮培养的MDCK细胞的形态，细胞呈单个分散状，无结团现象，细 胞形态完整，边界光滑清晰，大小均一；
[01巧]图3为采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮 培养的MDCKS细胞，图片来源:张良艳，姚志东，等.MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用.生物技 术通讯.2013，24(3): 382-384;图中可见，多个细胞聚集成团，少见单个细胞，细胞大小不均 -* · ，
[0196] 图4为采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMIF8间接法驯化得到的 MDCK.洲 S2 细胞；图片来源：V 丄 ohr，Y.Genzel, et al.A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined med ium in stirred-tank and wave bioreactor. Vaccine. 2010，28(3): 6256-6264;图中所见，在该无血清培养基中悬浮培养时 细胞形态也呈聚集状，但聚团较小，细胞大小不均一，状态略欠。
[0197] 在本实施例将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养状态，该细胞呈单个分散生 长，细胞形态饱满，大小均一;细胞质量高。
[019引实施例5
[0199] 对得到的全悬浮培养的MDCK细胞测定活细胞密度和细胞活性，结果如图5所示： MDCK贴壁细胞在无血清培养基中驯化6代W后（驯化后第13d)，细胞生长逐渐稳定，细胞活 性保持在95% W上。由此可W证明，通过本发明的对MDCK贴壁细胞驯化的方法使MDCK贴壁 细胞适应悬浮培养并稳定生长只需2周，大大缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的 全悬浮细胞驯化时间。
[0200] 实施例6
[0201] 本实施例用于说明适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的 制备方法及通过该方法获得禽流感病毒特性：
[0202] 一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，包括 W下步骤：
[0203] 1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞:将MDCK细胞装入摇瓶，在转 速13化pm，溫度37°C、通入浓度为5%的C〇2的条件下，置于培养箱中培养;然后每12h取样一 次，进行细胞计数;在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞 密度为0.5 X 106cel 1 s/mL，并W此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待 接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；
[0204] 2)准备毒种：准备鸡胚源H9N2亚型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 ID 日 o/O.l血；
[0205] 3)F1代病毒驯化:按培养基体积的1%。接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种 于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶进行培养;每1化检测 病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h;培养F1代病毒的溫 度为37°C;
[0206] 4)F2代病毒驯化:取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本;培养F2代病毒的溫度为37 V;
[0207] 5)F3代病毒驯化:取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清 液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中， 并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本;培养F3代病毒的溫度为35 。。
[020引6)F4~F10代病毒驯化:重复步骤5)的过程培养F4~F10代，得到驯化完成的禽流 感病毒。
[0209] 禽流感病毒的血凝效价检测结果如表3所示：
[0210] 表3MDCK细胞驯化病毒血凝效价
[0211]
[0212]禽流感病毒经过MDCK细胞驯化至F6代，血凝效价明显提高；并且在48-7化的血凝 效价达到9-101og2。驯化至巧代，血凝效价稳定达到101og2,连续传代到9-10代，血凝效价 可达到lllog2。
[0213] 从各代次的禽流感病毒感染MDCK细胞72h后收取培养基上清液样本，测量血凝效 价及病毒含量，结果如表4所示：
[0214] 表4驯化毒血凝效价和病毒含量测定
[0215]
[0216]
[0217] 驯化禽流感病毒第F10代后7化血凝效价达11 log2,病毒含量稳定提升，在F10代达 到 1〇8·8εΙ〇5〇/0.1 血。
[0218] 对于本领域的技术人员来说，可根据W上描述的技术方案W及构思，做出其它各 种相应的改变W及变形，而所有的运些改变W及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。
【主权项】
1. 一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征 在于包括以下步骤： 1) 制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速 130rpm，温度37°C、通入浓度为5%的⑶2的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一 次，进行细胞计数;在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞 密度为〇 . 5 X IO6ce11 s/mL，并以此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待 接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞； 2) 准备毒种:准备鸡胚源禽流感病毒； 3. F1代病毒驯化:按培养基体积的1%。接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步 骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5yg/mL的TPCK-胰酶进行培养;每12h检测病毒 血凝效价和病毒滴度并留取Fl代培养基上清液样本，连续观察96h;培养Fl代病毒的温度为 37 °C； 4. F2代病毒驯化:取Fl代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的Fl代培养基上清液样 本，重复步骤3)的过程，即将Fl代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检 测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本;培养F2代病毒的温度为37°C; 5. F3代病毒驯化:取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样 本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检 测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本;培养F3代病毒的温度为35°C; 6 )F4~FlO代病毒驯化:重复步骤5)的过程培养F4~FlO代，得到驯化完成的禽流感病 毒。2. 如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于:步骤1)中，所述装入摇瓶并置于培养箱中培养的MDCK细胞为通过无血 清培养基从需血清贴壁培养的MDCK细胞驯化为全悬浮培养的MDCK细胞。3. 如权利要求2所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于:所述全悬浮培养的MDCK细胞通过以下步骤驯化得到： I)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80~90%时，弃去培 养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液;再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK 细胞进行消化5~15min;待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化;然后收集细胞 悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团； Π )将步骤I)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1 .3~I .6 X 106cellS/mL，获得细胞重悬液； ΙΠ )将步骤Π )中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37°C、5%CO2的条件下 置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升 至120rpm;每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3~1.6 X 106ce 11 s/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。4. 如权利要求1-2任一所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病 毒的制备方法，其特征在于:所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分： 基础代谢营养物： D-葡萄糖 3000 叫 0000mg/L:; 丙酮酸钠 50 - 600rag/L; L-丙氨酸 5~3Omg/L; L-精氨酸 15:0 ~ 600mg/L; L-天冬醜胺 1.0 ~ 60mg/L; L-天冬氨酸 10 ~ 60mg/L; L-胱氨酸 丨0-80mg/L; L-半胱氣酸 20 - 150mg/L; L-谷氨酸 5 ~ 60mg/L; L-谷氨酰胺 300~ 1500mg/L; 甘氨酸 10 ~ LOQmg/L; L-组氨酸 10 M50mg/L; L-异亮氨酸 20-150mg/L; L-亮氨酸 50 ~ 250mg/L; L-赖氨酸 50~150mg/L; L-曱硫氨酸 20 ~ 150mg/L; L-苯丙氨酸 20 ~ 250mg/L; L-脯氨酸 20 ~ 200mg/L; L-丝氨酸 50 ~ 150mg/L; L-苏氨酸 50~200mg/L; L-色氨酸 20 ~ 100mg/L; L-酿氣酸 20 ~ IOOmgZL; L-缬氨酸 50 ~ 200mg/L; 核苷酸： 次黄嘌呤 2~25mg/L; /钩苷 0.1 ~ lmg/L; 腺苷 2~15mg/L; 尿苷 2~_15mgZL; 胞苷 2 ^ 15mg/L; 鸟苷 2~15mg/L; 维生素： D-生物素 0.01 ~0.20mg/L; 叶酸 1~iOmg/L; 烟.醜胺 I _1.0mg/L._; 吡哆醇 1~10mg/L; 硫胺素 l~10mg/L; 核黄素 O I ~ lmg/L; 氯化胆減 10 ~ 5()irig/L; D-泛酸钙 2~10mg/L; 肌醇 10~50mg/L; 无机盐： 硝酸铁 10~50mg/L; 硫酸亚铁 0.1 ~ l.mg/L; 硫酸镁 2〇~丨00mg/L: 氯化钾 200 ~ 500mg/L; 氯化纳 5000 ~ 9000mg/L; 磷酸氢二钠 50~100mg/L; 磷酸二氫钠 50 ~ 100mg/L; 亚石西酸纳 20 ~ lOOmg/L; 剪切力保护刑: 5QO ~ 2500mg/L; 抗细胞结爾剂: 20- 150mg/L; 酸碱度缓冲剂： 碳酸氢钠 1000~3000mg/L; 酸碱度指示剂： 酸红 5~15mg/L; 流感病毒增殖促进剂： 胆固醇 1~10mg/L; DL-Ct-生育酚醋酸酯 0.3 ~ 3mg/'L; 豆蔻酸 0.05~0.5mg/L; 棕榈酸 0.05~0.5mg/L; 硬脂酸 0.05 ~ 0.5mg./L; 氯化镁 1000 ~5000mg/L; 氯化钙 5Q~25Qmg/L; 二曱基亚砜 2~20mg/L; 硫酸锌 〇，:2~2.0mg/L; 硫酸铜 5~25mg/L; 硫酸锰 0.0001 ~ 0.001mg/L; 偏机酸铵 0 001 ~ 0.005mg/L; 其它添加物： 柠檬酸铁铵 13,5~40.5mg/L; 腠岛素 2~15mg/L; 大豆水解物 丨OOO ~ 5000mg/L; 乙醇胺 I10.mg/L; 谷胱甘肽 0.5~3mg/L〇5. 如权利要求4所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于:所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。6. 如权利要求4所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于:所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。7. 如权利要求1-2任一所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病 毒的制备方法，其特征在于:所述无血清培养基通过以下步骤制得： 将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10~30°C溶剂中溶解，得到混合液;调节混 合液的pH至6.3~6.7，定容后得到无血清培养基。8. 如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于:所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。9. 如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制 备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述鸡胚源禽流感病毒的病毒含量多IO 6^EID50/ 0.IrnL010. -种禽流感病毒，其特征在于:通过权利要求1-9任一所述的制备方法获得。
【文档编号】C12N5/02GK106011083SQ201610486914
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】陈瑞爱, 赖汉漳, 刘玉鹏, 詹烜子, 刘旭平, 麦康聪, 汤钦, 盘伟岚, 许东蕾, 陈华坚
【申请人】广东温氏大华农生物科技有限公司, 华东理工大学, 肇庆大华农生物药品有限公司